BIOTECHNOLOGIA

Wykład 4  17.03.2006

Część pierwsza: Historia biotechnologii (pogrubione - daty, które uznał za WAŻNE)

·         1830 odkryto białka

·         1833 pierwszy odkryty i wyizolowany enzym

·         1835-55 Schleiden i Schwann – teoria komórkowa

·         1857 Pasteur /odkrycie, że za fermentacje odpowiedzialne są bakterie i drożdże/

·         1859 Darvin /"On the Origin of Species" i selekcja naturalna /

·         1870-90 nitrogen-fixing bacteria to improve yields + W.J.Bal – pierwsza eksperymentalna hybryda kukurydzy

·         1877 Koch  /rozwój technik hodowli, oglądania, identyfikacji i zabijania mikroorganizmów/

·         Prasa French’a (French Press) – wynalazca był French

Do kolumny bardzo odpornej na wysokie ciśnienie wtłacza się pod dużym ciśnieniem zawiesinę bakteryjną (czymś przepłukaną). Zawiesina bakteryjna w kolumnie jest przepychana pod mocnym ciśnieniem do bardzo wąskiego otworu, znacznie węższego niż średnica bakterii ® mechaniczne rozbijanie komórek.

Jest to najbardziej efektywna metoda rozbijania kom. bakteryjnych, bo mniejsze elementy typu organelli kom. nie ulegają zniszczeniu.

Jest droga, ale to jedyne urządzenie do rozbijania kom. w celu uzyskania organelli.

·         1878 G. Leval ® Wirówka (centryfuga)

Pierwsza wirówka była ręczna, na korbę i pozwalała na oddzielenie cząstek stałych od cieczy. Teraz stosuje się takie w spółdzielniach mleczarskich do oddzielania tłuszczu od mleka i produkcji masła.

Jedno z większych odkryć technologicznych, bardzo ważne dla biotechnologii.

Zastosowanie w biotechnologii:

Þ wirówka Eppendorfa

-          np.: izolacja DNA – niezbędna do rozdzielania DNA od roztworów

-          odwirowywanie małych ilości hodowli bakteryjnych do uzyskania osadu

-          minipróby (objętości mililitrów)

-          nie osiąga dużych szybkości, ale za to bardzo szybko się rozpędza

Þ ultrawirówki ( wirówki skomplikowane)

Programuje się je i osiągają one bardzo duże szybkości.

Służą do izolacji bardzo drobnych cząstek, do izolacji i rozdzielania różnych rodzajów DNA, jeżeli wirowanie odbędzie się w programie gradientowym np. gradiencie sacharozy, to wtedy DNA z komórki ulega rozwarstwieniu na DNA plazmidowe, chromosomalne (inne formy konformacyjne DNA można w ten sposób też wyizolować).

·         1879 Fleming odkrywa chromatynę

·         1890 Drosophila – początki genetyki

·         1902 pojawienie się terminu Immunologia

·         1906 pojawienie się terminu Genetyka

·         1911 odkrycie pierwsze wirusa powodującego raka

·         1914 użycie bakterii do rozkładu osadu ściekowego

Po raz pierwszy odbyło się to w Manchesterze, „Wazowiński” zastosował praktycznie bakterie do utylizacji ścieków.

·         1919 pierwsze użycie słowa biotechnologia

·         1928 A. Fleming odkrywa penicylinę (pierwszy antybiotyk)

Odkrycie bardzo ważne, II Wojna Światowa wymagała bardzo dużej ilości antybiotyków, ale penicylina weszła w użycie w 1943/44, więc trochę się spóźniła (od odkrycia do wdrożenia antybiotyku upływa okres co najmniej 10-cio letni)

·         1941 pojawienie się terminu Inżynieria Genetyczna

Duński mikrobiolog A. Jost pracował w Polsce w instytucie we Lwowie i pierwszy użył tego terminu podczas wykładu dotyczącego rozmnażania drożdży

·         1942 użycie mikroskopu elektronowego do identyfikacji i charakterystyki bakteriofaga

·         1944 Avery – udowodnił ze DNA jest nośnikiem genetycznym

·         1953 Watson i Crick - artykuł w Nature o DNA jako jednostce dziedziczenia

Bardzo ważny w dziejach biotechnologii, zapoczątkował „dalsze badania”.

·         1956 A. Kornberg odkrywa Polimerazę DNA I

Jej funkcją jest replikacja, naprawa uszkodzen DNA; teraz wykorzystywana w różnych technikach biotechnologicznych.

Polimeraza T6 i DNA I – replikacja DNA podczas sekwencjonowania DNA na nitkach bakteriofagów (stara metoda umożliwiająca sekwencjonowanie genów); na bakteriofagu M13, na jego genomie syntetyzowała się druga nić, a w drugiej nici te elementy, które były klonowane przez pierwszą nić, powstawały sekwencje bardzo normalne. /nie wiem o co biega /

·         1959 odkryto interferon, stworzono pochodne i syntetyczne penicyliny - był to pierwszy syntetyczny antybiotyk

·         1961 biopestycyd Bacillus turingiensis (Bt), pałeczka owadobójcza

·         1970 odkrycie enzymów restrykcyjnych

Generalnie systemy restrykcji i modyfikacji u bakterii odkryto w latach 60tych.

To system, który modyfikuje DNA kom. bakterii po to, żeby chronić ją przed wtargnięciem obcego DNA. Należą do niego regulatory (enzymy regulatorowe) np.: metylaza DAM, której zadaniem jest metylacja DNA. Jeżeli w komórce bakterii działa ten system i na drodze przypadkowej transformacji dostanie się obce DNA albo w procesie transdukcji dostanie się DNA bakteriofaga, i jeżeli system restrykcji zacznie działać to i na DNA intruza i na własne DNA. Dlatego własne DNA jest metylowane i jest ono odporne na działanie enzymów restrykcyjnych (bo miejsca specyficzne na działanie enzymów restrykcyjnych są metylowane).

Fagi rozwinęły system metylacji własnego DNA i wtedy nie są rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne żywiciela (metylazy wirusowe).

Enzymy restrykcyjne pozwoliły na: mapowanie DNA, tworzenie map restrykcyjnych DNA, na składanie/klonowanie/ i rozkładanie genów, na składanie nośników DNA.

·         1973 Stanley Cohen i Herbert Boyer użycie enzymów restrykcyjnych do klonowania

(konstrukcja wektora plazmidowego i transformacja nim E. coli). Po raz pierwszy w pełni opracowali technikę wycinania i wklejania DNA za pomoca enzymów restrykcyjnych i ligaz - umożliwiło to klonowanie i ekspresję nowego DNA w E. coli

·         1975 pierwsze przeciwciało monoklonalne

·         1976 klonowanie w E. coli genów innego gatunku (org. eukariotycznego – rośliny) – (ekspresja genów drożdżowych w E.coli)

·         1979 odkrycie polimerazy

·         1980 Nobel w dziedzinie chemii Berg / Gilbert / Sanger

Otrzymanie pierwszej zrekombinowanej molekuły. To początek rozwoju szczepionek nowej generacji, stosowania wektorów transportujących dowolne elementy genetyczne po organizmie (sztucznych plazmidów).

/ P. Berg (USA) - Chemia
- za podstawowe badania biochemii kwasów nukleinowych, szczególnie dotyczące rekombinacji (wymieszania materiału genetycznego) DNA.
W. Gilbert (USA) i F. Sanger (Wielka Brytania) - Chemia
- opracowanie metod sekwencjonowania DNA (ustalania kolejności nukleotydów w cząsteczce). /

·         1983 K. Mullis – opracowanie metody PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy)

/uznałem, że lepiej wkleić z netu niż pisać to co powiedział o zasadzie PCRu/

PCR to reakcja służąca do amplifikacji (namnożenia) wybranego fragmentu DNA in vitro. Reakcja, która jest prowadzona w termocyklerach, wymaga: termostabilnej polimerazy DNA (np. polimerazy Taq), wolnych trójfosforanów nukleotydów, jonów Mg2+ oraz primerów.

Primery (startery) są krótkimi (zazwyczaj 18-24 nukleotydów długości), jednoniciowymi fragmentami DNA, które łączą się (hybrydyzują) z komplementarnym fragmentem DNA i umożliwiają polimerazie DNA rozpoczęcie reakcji.

Pierwszym etapem reakcji jest denaturacja podwójnej helisy DNA, która zachodzi w temperaturze ok. 95˚C. Następnie temperatura jest obniżana do ok. 50˚C, co umożliwia połączenie się primerów z komplementarnymi sekwencjami. W końcu, temperatura jest podnoszona do ok. 72˚C i rozpoczyna się reakcja polimeryzacji, w wyniku której powielany jest fragment zawarty pomiędzy dwoma primerami. Ta sekwencja cykli jest powtarzana wiele razy, w zależności od ilości materiału, który chce się uzyskać.

Wykorzystanie termostabilnej polimerazy zapobiega nieodwracalnemu zniszczeniu enzymu podczas etapu ogrzewania próbki do temperatury denaturacji podwójnej helisy DNA.

Jeżeli primery znajdują się na początku i na końcu genu to polimeraza zsyntetyzuje ten gen. Jeżeli zaprojektujemy startery, które maja sekwencje charakterystyczne dla enzymu restrykcyjnego pożądanego przez nas, to okaże się, że dany zsyntetyzowany gen będzie miał końcówki z zaprojektowanych przez nas primerów. Umożliwi to proste klonowanie, bo z genami mającymi końcówki enzymów restrykcyjnych (które są potrzebne, żeby wstawić/ zligować gen do wektora) to jest prosto ® klonowanie na własne końce.

Kiedyś klonowało się klasycznie: DNA chromosomalne cięto enzymami restrykcyjnymi, na podstawie mapy restrykcyjnej wybierano „odpowiedni” prążek z żelu i robiono shotgun, czyli klonowano bardzo dużo przypadkowych cząstek DNA do wektorów, ale było to bardzo żmudne i PCR ogranicza to poszukiwanie do jednego genu.

Można w PCR zsyntetyzować geny z jedną zasadą zmienioną ® wektory mutacyjne (do uzyskiwania mutantów punktowych). Można produkować fragmenty genów, klonować je do wektorów insercyjnych i na drodze insercji uzyskiwać mutanty insercyjne (dzięki rekombinacji homologicznej).

Kryminalistyka (ustalanie ojcostwa, szukanie DNA na miejscu przestępstwa).

Diagnostyka chorób (nowotwory, identyfikacja bakterii chorobotwórczych).

·         1986 pierwsze transgeniczne rośliny (np.: pomidory odporne na wirusy)

Uznanie roślin transgenicznych przez władze i utworzenie The Environmental Protection Agency

·         1987 rośliny odporne na wirusy - były to pomidory, które stały się pierwszymi modyfikowanymi genetycznie roślinami dopuszczonymi do testów polowych

·         1989 bawełna odporna na owady (gen Bt został wklonowany do rośliny i sama w sobie stała się oporna na konsumpcje przez owady).

·         Lata 90 rozwój genomiki

/ nauka zajmująca się sekwencjonowaniem, oraz porównawczą i eksperymentalną analizą całych genomów/

·         1990 projekt genomu ludzkiego stał się międzynarodowym, finansowanym przez bardzo wiele instytucji.

Wyhodowano pierwszą krowę (pierwsze zwierzę) zmodyfikowaną genetycznie, która produkowała mleko. Do tej pory badania prowadzono na roślinach i myszach (trasngeniczne myszy).

Pierwsza kukurydza odporna na owady (Bt corn)

Wykrywanie chorób nowotworowych (1994 – wykrycie i opisanie genu związanego z nowotworami piersi).

Rozwój biotechnologii medycznej (nowotwory, choroby genetyczne ® rozpoznawanie i opisywanie genetycznych mechanizmów tych chorób).

·         1996 znalezienie genu związanego z chorobą Parkinsona (udało się opisać przyczyny choroby, co być może umożliwi jej leczenie w przyszłości).

Jeżeli znamy mechanizm genetyczny choroby możemy stworzyć układ zastępując te geny, które wywołują chorobę; czyli zmutowane geny można podmienić dzięki wektorom na te właściwe.

·         1997 owca Dolly została wyhodowana (duże osiągnięcie w biotechnologii zwierząt)

·         1998 postęp w realizacji projektu ludzkiego genomu (utworzono mapę genomu ludzkiego pokazującą lokalizację ponad 30000 genów)

·         2000 pierwszy genom roślinny (A.thaliana) został wyznakowany
Arabidopsis thaliana - podstawowa roślina używana przez biotechnologów roślin. Jak poznano genom A.thaliana to można było przenosić geny do innych roślin; przeniesino geny A.thaliana do pomidorów. Uzyskano pomidory odporne na słone środowisko (rosną na słonej glebie, a nie są słone w smaku).
Testowanie pierwszego pola zmodyfikowanej genetycznie kukurydzy; odporny na wirusy słodki ziemniak (2001) - po raz pierwszy testowano go w Kenii.

·         2001 kompletna mapa genomu ryżu - pierwszej rośliny uprawnej

·         Co się dzieje teraz (2002-2005):
Rozwój proteomiki (badanie białek - ich struktury, sprawowanych przez nie funkcji i zależności między nimi). Pierwsza mapa funkcjonalna proteomiczna została stworzona dla drożdży w 2002r (genom drożdży poznano w 1996).
Mamy teraz pełna mapę genomu człowieka.
Rośliny transgeniczne (pola GMO zajmują 145 milionów akrów w 16 krajach; dokonał się 12% wzrost liczby pól uprawnych GMO w stosunku do roku 2001; więcej niż ¼ globalnego areału GMO mieści się w 9 krajach rozwijających się)
Mapowanie wszelakich organizmów – np. patogena ryżu

Część druga: Bakterie mające duże znaczenie w biotechnologii

              Biotechnologia, to nie tylko „dobre bakterie”, służące produkcji czy klonowaniu, to także „złe”, których się boimy. Ale i one mają swoje zastosowanie w biotechnologii.

              Każdy z nas każdego dnia wraz z posiłkami i wodą zjada także bakterie. To, że się natychmiast nie zarażamy i nie chorujemy, związane jest z dawką bakterii, która do nas dociera. Większość sa to patogeny oportunistyczne. Groźniejsze są bakterie przetrwalnikujące, gdyż przetrwalniki nie są niszczone przez używane na co dzień środki dezynfekujące. Co groźnego znajduje się w posiłkach?

Patogeny żywności:

1.      Staphylococcus aureus

-          gronkowiec złocisty

-          szczepy MRSA - Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus - szczepy gronkowca wywołujące trudne do zwlaczenia infekcja szpitalne, które są odporne na większość popularnie stosowanych antybiotyków

-          powoduje zakażenia przyranne, powikłania po skaleczeniach

-          produkuje termostabilną toksynę, którą likwiduje dopiero bardzo wysoka temperatura

-          zakazić się można poprzez spożywanie produktów mlecznych, np. lodów
(mały bonus, nie do końca słyszę, co było mówione na wykładzie, więc uzupełniam z netu:)

-          pożywką dla gronkowca złocistego staja się popularne pokarmy: lody, ciastka z kremem i budyniem, jajka i sałatki garmażeryjne. Ponadto: mleko i nabiał, mięso i przetwory mięsne („tatar”, kotlety mielone), wędliny (np. kaszanki, salceson), drób oraz przetwory z ryb.

-          gronkowiec występuje bezobjawowo w nosie i gardle, na włosach i na skórze zdrowych osobników.

2.      Salmonella

-          gramujemna bakteria, czyli w barwieniu Grama barwi się na czerwono

-          powoduje biegunki, tzw. Czerwonki bakteryjne, o bardzo burzliwym przebiegu

-          raz zakażona osoba może stać się nosicielem (robi się testy nosicielstwa np. w badaniach sanepidu wymaganych do pracy z żywnością)

-          to choroba „brudnych rąk”, można się także zakazić jedząc niemyte owoce
...