wykład 9.doc

BIOTECHNOLOGIA WYKŁAD 9

3 podstawowe drogi biosyntezy metabolitów wtórnych:

I  - szlak polipeptydowy, droga ta jest zbliżona do pierwszych etapów    biosyntezy kwasów tłuszczowych

II - biosynteza z wykorzystaniem aminokwasów, na drodze innej niż wykorzystanie aparatu translacji i transkrypcji, polega na aktywacji aminokwasu przy wykorzystaniu ATP, zaktywowana grupa karboksylowa jest przenoszona na resztę aminową innego aminokwasu

III –  biosynteza z wykorzystaniem jednostek pięciowęglowych, biosynteza terpenoidów, polega na kondensacji 3 jednostek acetyloCoA a następnie przekształcania tych jednostek (redukcji, fosforylacji), powstaje jednostka pięciowęglowa: pirofosforan izopentenylu albo  pirofosforan dimetyloalgilu i te 2 jednostki brały udział w biosyntezie terpenoidów – tak jest u większości organizmów: we wszystkich organizmach zwierzęcych, u grzybów, w mitochondriach, u eubakterii, również w roślinach na terenie poza plastydowym. U części bakterii i w plastydach roślinnych występuje jeden szlak, a faktycznie z 2 jednostek trójwęglowych (a w zasadzie z jednostki trójwęglowej i octanu) powstaje jednostka pięciowęglowa. W wyniku szeregu przemian jest przekształcana do ufosforylowanej jednoski pięciowęglowej i są syntetyzowane terpenoidy:

- w roślinach na terenie cytozolu powstają głównie terpenoidy C15 i C30, natomiast na terenie chloroplastów- terpenoidy C10, C20, C40 – rozdzielenie obu tych szlaków (więc jeśli chcielibyśmy wspomagać syntezę jakiegoś terpenoidu na początku musielibyśmy wiedzieć do jakiej klasy związków się on zalicza… (czy jest seskwiterpenem, monoterpenem, tetraterpenem).

Jeśli jest tetraterpenem nie należy dodawać kwasu mewalonowego bo ten związek nie jest prekursorem.

  Kiedyś były doświadczenia, że kwas mewalonowy świetnie był łączony do triterpenów a nie był do tetraterpenów…

   Podejrzewano, że jest dodatkowa przeszkoda w postaci podwójnej błony, która utrudnia wnikanie mewalonianu do chloroplastu, tworzono różne hipotezy…A jak jest na prawdę: mewalonian wnika do chloroplastów, ale jest w bardzo niewielkim stopniu wykorzystywany do biosyntezy karotenoidów.

   Regulacja metabolizmu wtórnego:

- metabolizm podlega tym samym zjawiskom jak wszystkie procesy regulacyjne w komórce.

Dla każdego organizmu możemy wyróżnić poziom:

- poziom organizmalny

- poziom komórkowy

- poziom regulacji poszczególnych szlaków, enzymów w których one działają

SLAJD1:

              Regulacja biosyntezy metabolitów wtórnych (specyficznych, idiolitów) podlega podobnie jak regulacja metabolitów pierwotnych kontroli na różnych poziomach i w różnych miejscach szlaku biosyntezy. Regulacja ta może mieć miejsce na poziomie:

•         -          biosyntezy prekursorów

•         -          konkurencji o te prekursory z innymi szlakami metabolizmu pierwotnego czy wtórnego

•         -          dostępności energii metabolicznej (ATP, NADPH)

•         -          transportu komórkowego.

Mechanizmy regulacyjne uczestniczące w tych procesach to:

•         -          represja: kataboliczna, wywołana przez metabolity,

•         -          indukcja: substratowa, przez efektory metaboliczne

•         -          regulacja: związkami azotu, fosforanowa i energetyczna

•         -          hamownie przez sprzężenie zwrotne

•         -          regulacja różnymi czynnikami tj. pierwiastki śladowe, tlen, temperatura czy pH.

              Ponieważ jak się wydaje u drobnoustrojów metabolity wtórne nie są zaangażowane w podstawowych procesach życiowych, dlatego też ich synteza podlega represji w warunkach intensywnego wzrostu wegetatywnego, a derepresję obserwuje się w warunkach wyraźnego ograniczenia czy też zahamowania ich wzrostu. Istotną rolę w inicjacji biosyntezy tych metabolitów odgrywa brak łatwo przyswajalne składniki pożywki np. glukozy, czy poziom jonów amonowych czy fosforanowych.

Mechanizmy regulujące biosyntezę idiolitów powodują, że w szczepach dzikich poziom biosyntezy tego typu związków jest niski. Dlatego w biotechnologii wykorzystuje się w tym celu mutanty, w których działanie tych mechanizmów jest ograniczone czy całkowicie wyeliminowane.

Tak samo jest w przypadku metabolitów wtórnych z tym, że oprócz tych mechanizmów regulacyjnych dochodzą jeszcze inne mechanizmy:

1) regulacja biosyntezy prekursorów

2) regulacja metabolizmu pierwotnego, który dostarcza szkielety, metabolity wyjściowe szlaku, z drugiej strony - na konkurencji prekursory (wykorzystywane zarówno w metabolizmie wtórnym jak i pierwotnym).

3) dostępność energii – ATP i czynników redukujących ( poziom bardzo ważny dla metabolizmu pierwotnego, konieczny by organizm mógł wzrastać)

W przypadku nadprodukcji - na ogół nie odbywa się ona w czasie intensywnego zrostu grzybni czy organizmu, czy namnażania się organizmów komórkowych, lecz ma miejsce w momencie stacjonarnym, gdy warunki hodowli się zmieniają, względnie gdy nastąpi duże zagęszczenie, pojawiają się metabolity szlaku, które częściowo mogą zatruwać środowisko czy zmieniać je i wtedy uruchamiany jest metabolizm wtórny. Są to związki często o charakterze obronnym czy ochronnym, w momencie gdy warunki są niesprzyjające powinny być dodatkowo uruchamiane…

Transport – dostarczanie substratów do miejsca reakcji czy usuwania produktów z tego miejsca.

Mechanizmy regulacji metabolizmu wtórnego:

- represja kataboliczna – represja spowodowana obecnością łatwo dostępnego źródła węgla, najczęściej jest pierwotnym czynnikiem, który powoduje zahamowanie biosyntezy (gdy jest łatwo dostępne źródło C)

- indukcja substratowa

- przez metabolity, nie zawsze muszą być związane z danym szlakiem komórkowym

- stężenia N, fosforu, poziom energetyczny komórki

- mechanizm sprzężenia zwrotnego – ten mechanizm jest charakterystyczny dla wszystkich przemian komórkowych – w tym wypadku jest związany nie tylko z produkcją metabolitu wtórnego, który nas interesuje ale też z produkcją związków wyjściowych czy metabolitów pośrednich.

- czynniki takie jak natlenienie, pH itd. Wpływają na metabolizm wtórny.

W przypadku mikroorganizmów metabolity wtórne ze względu na występowanie tych wszystkich mechanizmów regulacji nie występują w dużych stężeniach. Związki pojawiają się w momentach niesprzyjających.

  Skoro mają umożliwiać przeżycie to dlaczego w momentach niesprzyjających są syntetyzowane w niewielkich ilościach ??

- by zwalczyć otaczających sąsiadów i zwiększyć tym samym dostępność zasobów wkoło.

Drogi metabolizmu muszą być uruchamiane w jakimś momencie, czyli muszą być regulowane przez jakieś związki. Czy biosynteza enzymów może być regulowana przez syntezę jakiś związków w komórce… np. w komórce Streptomyces występuje czynnik A, który jest związkiem, który powoduje w warunkach niesprzyjających sporulację (ułatwia sporulację).Normalnie jest nieaktywny metabolicznie, ale w warunkach sprzyjających może wrócić do formy aktywnej. Z drugiej zaś strony jest odpowiedzialny za uruchomienie metabolizmu wtórnego - za biosyntezę charakterystycznych dla tego organizmu antybiotyków glikoaminowych – streptomycyny. Albo pojawienie się tego czynnika powoduje związanie się z represorem genów związanych z biosynteza antybiotyku enzymów czy też można sobie wyobrazić inny mechanizm - ale ten jest najprostszy – związanie represora i uruchomienie enzymu, w następnej kolejności biosyntezę antybiotyku. Niektóre mikroorganizmy maja uszkodzoną biosyntezę tego induktora. Z jednej strony nie są w stanie wytwarzać spor ani nie są w stanie biosyntetyzować antybiotyku, a z drugiej strony jeżeli dodamy ten związek do pożywki to wytwarzają spory i produkują antybiotyki.

SLAJD2:

Indukcja metaboliczna

               W przypadku drobnoustrojów o złożonym cyklu rozwojowym wytwarzane są efektory metaboliczne spełniające istotną rolę w przełączaniu metabolizmu, w różnicowaniu fizjologicznym i morfologicznym. Są one uważane za pierwotne sygnały inicjujące tego typu zmiany. Często ze względu na to, że są syntetyzowane w tych samych komórkach, w których działają określa się je mianem autoregulatorów. Od autoregulatora jakim jest cAMP efektory drobnoustrojów różnią się wysoką swoistością regulowanych przemian oraz ograniczonym występowaniem.

              U promieniowców, a właściwie w szczepach Streptomyces griseus wykryto odpowiedziałny za sporulację oraz produkcję streptomycyny autoregulator nazwany Faktorem A. Jest to lakton kwasu 2-izokapronoilo-3-hydroksymetylo-4-hydroksybutanowego.

Mutanty niezdolne do jego syntezy tracą również zdolność do syntezy antybiotyku oraz obserwuje się u nich poważne zaburzenia w procesie sporulacji. Podany takim mutantom syntetyczny czynnik przywraca obie te funkcje. Przy czym 1 ng efektora powoduje produkcję 1 mg antybiotyku, co daje współczynnik indukcji równy 106.

   Oprócz takiej indukcji przez taki induktor, który nie ma nic wspólnego ze szlakiem można sobie wyobrazić pewne przemiany indukowane przez obecność nadmiaru substratu w komórce najczęściej mamy wtedy do czynienia z tym, że ten substrat nagromadza się w czasie intensywnego wzrostu komórki, Nagromadzenie się w czasie stanu stacjonarnego również będzie powodowało wzrost syntezy tylko ze wtedy nie mamy pewności czy to nie jest związane z dostępnością substratu, gdy mamy indukcję substratową (tego typu indukcje obserwujemy w przypadku biosyntezy cefalosporyn). Przypadku biosyntezy antybiotyków peptydowych (np. beta- laktamy, do nich też cefalosporyna należy). Cefalosporyna – układ pierścieniowy C4C,6 wymaga izomeryzacji w czasie metabolizmu, ale obie te grupy powstają z trzech aminokwasów: jeden aminokwas nie białkowy –alfa-aminoadypinian, drugi cysteina, trzeci walina. W przypadku biosyntezy cefalosporyn takim induktorem jest nagromadzenie się w fazie intensywnego wzrostu – metioniny. Przy czym metionina może zostać zastąpiona cysteiną (produkcja aminokwasów- z asparaginianu powstają 3 aminokwasy: lizyna, metionina, leucyna, izoleucyna, treonina). Cysteina może powstawać z powstającej na tym szlaku metioniny. Metionina może być induktorem szlaku biosyntezy cefalosporyny.

  Z drugiej strony stwierdzono, że jeśli podana będzie nie metionina a cysteina – efekt jest podobny, w fazie stacjonarnej (gdy następuje przestawienie na metabolizm wtórny) - biosynteza cefalosporyny, ale również stwierdzono, że nowoleucyna (związek podobny do metioniny, nie zawierający siarki i pozbawiony jednego z atomów węgla) indukuje również biosyntezę cefalosporyny. Nie chodzi tylko oto żeby dostarczyć substrat, ale też o to żeby ten substrat w jakiś sposób indukował biosyntezę…

Jeśli się nie nagromadziło a dostarczyliśmy substrat, który jest jakimś analogiem, a który nie może być wykorzystywany do biosyntezy antybiotyków. Również obserwujemy wzrost, oprócz tego, że jest to jakiś substrat limitujący biosyntezę to również jest to substrat, który indukuje tą biosyntezę.

SLAJD3:

    Innym przykładem indukcji substratowej jest biosynteza alkaloidów sporyszu. Tutaj wyjściowym związkiem jest aminokwas aromatyczny - tryptofan (ma on grupę indolową C5C6, a w łańcuchu C5 atom azotu. W wyniku połączenia z pirofoforanem dimetyloalillu może być przekształcany w wyniku szeregu przemian do alkaloidów sporyszu – czyli związków, które mają w swej cząsteczce azot a nie są metabolitami pierwotnymi i wtórnymi. Nie są aminokwasami, zasadami purynowi i piramidynowymi, glikozydami cjanogenymi….a zawierają N w cząsteczce. Jeżeli nastąpi w czasie intensywnego wzrostu nagromadzenie tryptofanu w komórce to obserwujemy wysoki poziom nagromadzania się metabolitów wtórnych, natomiast efektu tego nie obserwuje się w momencie, gdy tryptofan zostanie podany w czasie gdy mamy do czynienia z biosyntezą metabolitów wtórnych. Mogą być różne powody tego;

- nagromadzenie się tryptofanu w komórce powoduje zwiększoną syntezę metabolitu wtórnego , mamy więcej substratu dla reakcji

- z drugiej strony związek ten jest induktorem, odblokowywuje, usuwa represor z DNA i umożliwia biosyntezę

- gdy metabolizm już trwa i podanie tryptofanu nie powoduje zwiększenia go. Dlaczego ??

Wydaje się być oczywistym, że gdy podajemy substrat z zewnątrz to produkcja powinna rosnąc … a tu nic.. można sobie wyobrazić ze jest upośledzony transport do przedziału komórkowego gdzie jest biosynteza lub do wnętrza komórki.

SLAJD4:

   By uzyskać większa produkcję alkaloidów sporyszu warto jest podawać do grzybni w czasie wzrostu prekursor aminokwasowi (zawierają one bowiem w swej cząsteczce azot).

Drugim mechanizmem regulacyjnym, który w przypadku produkcji metabolitów wtórnych przez mikroorganizmy jest dominujący jest represja kataboliczna – wywoływana przez obecność łatwo dostępnego źródła węgla (nie zawsze chodzi tu o glukozę może być glicerol czy cytrynian, w przypadku syntetycznej nowomicyny glukoza jest gorszym źródłem węgla). Pierwszym doniesieniem było to, że jak podawano grzybni glukozę to notowano spadek biosyntezy penicyliny. Omijano to poprzez dodawanie do grzybni, która wzrosła laktozy lub glukozy - ale w małych dawkach. Wyciągnięto wniosek – w represji katabolicznej decyduje szybkość wykorzystywania tego związku, bo jeśli jest niewiele to ilość powstających metabolitów jest niewielka. O szybkości...