Enzymy_restrykcyjne.pdf
(
120 KB
)
Pobierz
108833749 UNPDF
Charakterystyka enzymów restrykcyjnych
(endonukleazy restrykcyjne czyli restryktazy)
Enzymy restrykcyjne – enzymy izolowane z bakterii lub sinic, rozpoznające specyficzne
sekwencje i przecinające obie nici w cząsteczce DNA. Związane są ze zjawiskiem restrykcji i
modyfikacji, którego model zaproponowali Arber i Dusoix w 1962 roku. Model ten zakłada istnienie
w komórce dwóch enzymów w których jeden odpowiada za rozpoznanie specyficznej sekwencji i
przecięcie DNA a drugi za jego modyfikację, która zapobiega atakowi nukleolitycznemu.
Nazewnictwo – enzymy restrykcyjne określa się za pomocą symboli,
np. EcoRI – oznacza enzym wyizolowany ze szczepu R
Escherichia coli
,
Hind III – enzym wyizolowany ze szczepu
Hemophilus influenzae
serotyp d.
Liczba rzymska wynika z chronologii izolowania enzymów z tych samych mikroorganizmów.
Rozróżniamy trzy klasy enzymów restrykcyjnych, różniące się mechanizmem cięcia, rodzajem
substratu, produktu i kofaktorami:
Klasa I
– białka multimeryczne wymagające jako kofaktorów ATP, S-adenylometioniny i Mg
2+
●
działają zarówno jako restryktazy oraz kodyfikacyjne metylazy
●
substrat to dwuniciowy DNA zawierający zdefiniowaną sekwencję kilkunastu nukleotydów
●
enzym rozpoznaje sekwencje i w pewnej odległości od niej nacina obie nici DNA, nie
uzyskuje się ściśle określonych fragmentów DNA
Klasa II
– białka proste, występują w postaci dimerów i tetramerów,
in vitro
aktywowane Mg
2+
●
odpowiadające im metylazy występują jako oddzielne białka monomeryczne
●
substratem jest dwuniciowy DNA zawierający kilku nukleotydową sekwencje specyficznie
rozpoznawaną przez dany enzym
●
cięcie obu nici zachodzi w obrębie tej rozpoznanej sekwencji lub jej pobliżu (klasa IIS)
●
większość enzymów rozpoznaje palindromowe sekwencje (posiadające oś symetrii) cztero-,
sześcio-, lub ośmionukleotydowe. W wyniku ich cięcia mogą powstać dwa rodzaje końców
tzw „lepkie” i „tępe” końce
●
enzymy te znalazły największe zastosowanie w biologii molekularnej
Klasa III
– aktywowane przez jony Mg
2+
i ATP, czasem potrzebna jest S-adenylometionina.
Aktywność restryktaz zależy także od stężenia soli (NaCl) zawartej w buforze. Niektóre enzymy
wykazują maksimum aktywności przy wysokim stężeniu soli (150 mM), inne przy niskim stężeniu NaCl.
Są również takie dla których stężenie soli może być skrajnie różne (0-150 mM) np. AvaI.
Wszystkie enzymy restrykcyjne po trawieniu dwuniciowego DNA pozostawiają grupę
fosforanową na końcu 5', a grupę hydroksylową na końcu 3'.
Wydaje się, że przecięcie dwóch nici w obrębie rozpoznanej sekwencji nie zachodzi jednocześnie,
lecz jest wynikiem dwóch niezależnych reakcji katalitycznych. Stosując odpowiednio niskie stężenie
enzymu w stosunku do stężenia DNA można uzyskać cząsteczki z tylko jedną przeciętą nicią.
1
IZOSCHIZOMERY
– enzymy pochodzące z różnych szczepów, ale rozpoznające te same
sekwencje DNA. Na przykład sekwencję CCGG rozpoznają enzymy HpaII, HapII, MspI, BsnF.
Zastosowanie restryktaz:
1. Sporządzanie fizycznych map genomów,
2. Izolacja i identyfikacja genów, sekwencjonowanie DNA,
3. Porównywanie DNA z różnych organizmów,
4. Rekombinowanie i klonowanie określonych genów lub fragmentów genomu,
5. Diagnostyka chorób genetycznych,
6. Diagnostyka niektórych chorób nowotworowych,
7. Diagnostyka chorób infekcyjnych,
8. W transpalntologii do ustalania zgodności tkankowej,
9. W medycynie sądowej do ustalania pokrewieństwa.
2
Plik z chomika:
grab2co
Inne pliki z tego folderu:
mikromacierze.doc
(780 KB)
mikromacierze dna.pdf
(279 KB)
watsoncrick.pdf
(359 KB)
andrologia molekularna.doc
(101 KB)
wpływ badań genetycznych....pdf
(400 KB)
Inne foldery tego chomika:
fizjologia
mikrobiologia
Zgłoś jeśli
naruszono regulamin