Przedmiot: Enzymologia
Temat ćwiczenia:
Metody izolacji i oczyszczania enzymów
A. Izolacja i oczyszczanie α-amylazy.
B. Izolacja enzymów proteolitycznych z mięsa i wnętrzności ryb.
Wprowadzenie:
Źródłem enzymów mogą być tkanki roślinne, zwierzęce oraz komórki mikroorganizmów. Obecnie szerokie zastosowanie znajdują zwłaszcza enzymy pochodzenia mikrobiologicznego, ze względu na łatwość uzyskania dużych ilości homogennych enzymów.
Enzymy są przeważnie bardzo nietrwałe w środowisku o pH mniejszym niż 5 lub większym niż 9, łatwo ulegają też denaturacji cieplnej (powierzchniowej - podczas pienienia się roztworów) oraz są inaktywowane przez metale ciężkie. Izolowanie i oczyszczanie enzymów należy zatem przeprowadzać w taki sposób, aby zapobiegać utracie zdolności katalitycznych, tzn. w buforach o pH około 7, w niskiej temperaturze (najczęściej około 0oC), stosując wodę podwójnie destylowaną oraz środki kompleksujące metale ciężkie, a w razie konieczności również związki tiulowe, zachowując wyjątkową czystość na stanowisku pracy.
Dla każdego enzymu powinno się zastosować indywidualny schemat oczyszczania wykorzystujący jego własności fizykochemiczne. Pierwszym krokiem przy oczyszczaniu białek jest przeprowadzenie ich do roztworu, chyba że izolujemy je z płynnego źródła (np. z krwi, śliny itp.). Stosuje się w tym celu techniki doprowadzające do zniszczenia ścian, błon komórkowych lub struktury całych komórek, takie jak: degradacja ścian komórkowych przez lizozym, rozrywanie komórek pod wpływem ciśnienia osmotycznego, sonifikacja (pękanie komórek pod wpływem wibracji wywołanych ultradźwiękami) oraz homogenizacja, rozcieranie z piaskiem lub perełkami szklanymi i inne metody mechaniczne. Enzymy rozpuszczalne łatwo poddają się procesowi ekstrakcji wodą lub rozcieńczonymi roztworami soli i buforami. Natomiast związane z błonami wymagają użycia roztworów detergentów lub rozpuszczalników organicznych, które rozpuszczają lipidy. Dalsze metody stosowane w celu otrzymania preparatu enzymatycznego są bardzo różnorodne i ich stosowanie zależy od aktualnego i pożądanego stopnia oczyszczenia enzymu.
Najczęściej stosowanymi wstępnymi procesami oczyszczania są:
- frakcjonowanie roztworami soli (np. siarczanem amonu)
- ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi (np. etanolem, acetonem lub eterem).
Jako kolejny etap otrzymywania enzymów, szerokie zastosowanie ma obecnie chromatografia, elektroforeza, ultrawirowanie, stosowana jest także krystalizacja. Duże znaczenie w procesach oczyszczania białek mają techniki elektroforetyczne. Podobnie jak metody chromatograficzne mają one zastosowanie w przypadku wykonywania badań analitycznych (np. określania stopnia czystości izolowanych enzymów) jak i badań preparatywnych, wykonywanych w celu oczyszczenia białka.
Ultrawirowanie wykorzystuje znacznie wyższe przeciążenia (nawet powyżej 600 000 x g). W przypadku stosowania ultrawirowania w celach preparatywnych zazwyczaj prowadzi się ten proces w obecności substancji, która pozwala na otrzymanie gradientu gęstości. W obecności CsCl lub sacharozy gęstość roztworu wzrasta od powierzchni do dna naczyń wirówkowych, co pozwala na zwiększenie wydajności rozdziałów prowadzonych metodami ultrawirowania.
Proces oczyszczania enzymów wymaga ciągłej kontroli zarówno jakościowej (wzrastająca czystość białka), jak i ilościowej (badanie stężenia interesującego enzymu i/lub jego aktywności). Kontrole jakościową wykonuje się wykorzystując techniki elektroforetyczne (zwłaszcza SDS-PAGE). Do oznaczania stężenia enzymów wykorzystywane są natomiast zazwyczaj techniki spektrofotometryczne, np. metoda Lowry’ego, metoda biuretowa. Oznaczanie aktywności enzymów wykonuje się w oparciu o ich zdolności katalityczne.
Amylaza to ogólna nazwa enzymów hydrolizujących skrobię, do których zaliczamy α-amylazę, endoamylazę rozkładającą wiązania α-1,4-glikozydowe amylozy i amylopektyny; β-amylazę, rozkładającą skrobię od końca łańcucha, rozcinając wiązania α-1,4-glikozydowe oraz amyloglukozydazę i glukoamylazę, odcinające glukozę na końcu łańcucha skrobiowego, rozkładające zarówno wiązania α-1,4-glikozydowe, jak i α-1,6-glikozydowe. W wyniku działania α-amylazy powstają α-dekstryny o małej masie cząsteczkowej i niewielka ilość maltozy. W wyniku działania β-amylazy powstają duże amylodekstryny i znaczna ilość maltozy.
Z jodem skrobia daje zabarwienie niebieski, kolejne produkty pośrednie rozkładu skrobi dają odpowiednio barwę: niebieskofioletową (amylodekstryny), czerwoną (erytrodekstryny), czerwonobrunatną (achrodekstryny). Maltoza nie daje zabarwienia z jodem.
Optymalne warunki działania amylaz, to, w zależności od pochodzenia enzymu, pH lekko kwaśne (zbożowe) do obojętnego (zwierzęce), temperatura 50-65oC (zbożowe) i 37oC (zwierzęce), obecność jonów Cl-.
Wykonanie ćwiczenia:
A.
Zadanie 1. Otrzymywanie ekstraktów α-amylazy.
1) Ekstrakcja α-amylazy
a) Ekstrakcja α-amylazy z trzustki wieprzowej.
Pokroić 1 g trzustki wieprzowej. Odmierzyć w cylindrze 40 cm3 roztworu 1 mM CaCl2 i dodać około 30 cm3 do odważonej trzustki. Homogenizować 6 razy po 30 s z przerwami po około 30 s. Opłukać nóż homogenizatora pozostałymi 10 cm3 roztworu 1 mM CaCl2. Odwirować przez 15 min przy 9000g w temp. 4oC. Klarowny płyn zdekantować, zmierzyć jego objętość. Uzupełnić do 40 cm3 roztworem 1 mM CaCl2. Otrzymany roztwór jest ekstraktem, który stanowi podstawę do otrzymywania preparatu α-amylazy wieprzowej. Pobrać 5 cm3 do oznaczania stężenia białka i przechowywać w 4oC, resztę zachować do oczyszczania.
b) Ekstrakcja α-amylazy ze słodu jęczmiennego.
Do 2 g zmielonego słodu dodać 40 cm3 roztworu 1 mM CaCl2 w 20 mM CH3COONa. Wytrząsać przez 15 min, a następnie odwirować przez 15 min przy 9000g w temp. 4oC. Klarowny płyn zdekantować, zmierzyć jego objętość. Uzupełnić do 40 cm3 roztworem 1 mM CaCl2 w 20 mM CH3COONa. Otrzymany roztwór jest ekstraktem, który stanowi podstawę do otrzymywania preparatu α-amylazy słodowej. Pobrać 5 cm3 do oznaczania stężenia białka i przechowywać w 4oC, resztę zachować do oczyszczania..
2) Oczyszczanie α-amylazy przez wysalanie
Do 35 cm3 otrzymanych ekstraktów dodawać stopniowo (np. po 1 łyżeczce) krystaliczny (NH4)2SO4 do otrzymania roztworu 1,5 M (NH4)2SO4, czyli 6,93 g. Mieszać na mieszadle magnetycznym przez 20 min. Następnie odwirować przez 10 min przy 9000g w temp. 4oC. Klarowny roztwór zdekantować i zmierzyć jego objętość. Uzupełnić do 35 cm3 1 mM CaCl2 (dla amylazy trzustkowej) lub 1 mM CaCl2 w 20 mM CH3COONa (dla amylazy słodowej). Pobrać próbkę o objętości 5 cm3 do oznaczania stężenia białka i przechować w temp. 4oC. Osad odrzucić. Do pozostałej części roztworu dodawać stopniowo krystaliczny (NH4)2SO4, tak aby jego końcowe stężenie wyniosło 4 M (10 g na 30 cm3 roztworu). Mieszać na mieszadle magnetycznym przez 35 min i ponownie odwirować przez 10 min przy 9000g w temp. 4oC. Zlać supernatant, zmierzyć jego objętość. Pobrać 5 cm3 do oznaczania stężenia białka i przechowywać w 4oC, a pozostała część supernatantu odrzucić. Otrzymany osad wysolonych białek rozpuścić w 20 cm3 buforu uniwersalnego odpowiedniego dla danego enzymu.
3) Oznaczyć stężenia białka ogólnego metodą biuretową.
Zadanie 2. Oznaczanie stężenia białka metodą biuretową: Do kolbek odmierzyć po 1 cm3 kolejnych prób (do próby ślepej użyć wody destylowanej), dodać po 4 cm3 odczynnika miedziowego, do drugiego zestawu dodać po 4 cm3 odczynnika zmętnieniowego (wszystkie próby w 3 powtórzeniach). Po 30 min odczytać absorbancję przy długości fali 540 nm. Zawartość białka odczytać z krzywej wzorcowej (po uwzględnieniu zmętnienia), zestawić wyniki, biorąc pod uwagę rozcieńczenie.
B.
Zadanie 3. Otrzymywanie preparatu enzymów proteolitycznych pochodzenia zwierzęcego
5 g zmielonej tkanki rozetrzeć w moździerzu, dodawać powoli, małymi porcjami 10 cm3 zimnej wody destylowanej lub słabego roztworu NaCl (siła jonowa , 0,15), uważając by nie nastąpiło pienienie. Odstawić pod przykryciem do lodówki, po 15 min ponownie dokładnie rozetrzeć, powtarzać te operacje kilkakrotnie. Następnie przenieść do probówek i odwirować (10 min, 4000 obr./min). Ostrożnie zlać supernatant, który jest roztworem enzymów. Próbę przechować do następnych zajęć w stanie zamrożonym.
Zmierzyć objętość otrzymanego ekstraktu, pobrać 4 cm3 i uzupełnić do 20 cm3 (rozcieńczenie 5-krotne). W rozcieńczonym ekstrakcie oznaczyć stężenie białka ogólnego metodą biuretową (jak w zadaniu 2) oraz zbadać aktywność proteolityczną. W przypadku małej aktywności enzymatycznej badanej próby nie rozcieńczać ekstraktu enzymów, a zastosować ekstrakcję kilku prób. Otrzymania większej ilości ekstraktu pozwala uniknąć dodatkowego rozcieńczania, a przez to umożliwia osiągnięcie wyższych wartości absorbancji i zmniejszenie błędu względnego.
Zadanie 4. Oznaczanie aktywności proteolitycznej: Przygotować 6 probówek, do wszystkich wprowadzić po 1 cm3 roztworu enzymów. Do 3 probówek dodać po 4 cm3 hemoglobiny zdenaturowanej, wymieszać na wstrząsarce, inkubować 15 min w łaźni wodnej o temp. 37oC, a następnie dodać 5 cm3 10% TCA (kwas trichlorooctowy) i wymieszać. Próby odstawić na 15 min i przesączyć. W pozostałych probówkach przygotować próbę kontrolną, dodając do roztworu ekstraktu najpierw 5 cm3 10% TCA, a po wymieszaniu 4 cm3 hemoglobiny zdenaturowanej. Próby inkubować 30 min w temp. 37oC, a następnie przesączyć.
W przesączach oznaczyć produkty hydrolizy białka metodą Lowry’ego oraz absorbancję przy dł. fali 280 nm. Różnica między próbą i próbą kontrolną będzie odpowiadać próbie właściwej.
Zadanie 5. Otrzymywanie preparatu inwertazy z drożdży
a) Utrzeć w moździerzu 25 g drożdży z 5 g piasku (celitu) i 20 cm3 eteru. W czasie ucierania dodawać stopniowo 5 cm3 wody. Po 15 min ucierania przesączyć (przy użyciu pompy wodnej) i do przesączu wprowadzić 10 cm3 buforu octanowego o pH 4,5. Po oziębieniu do 0oC dodać 10 cm3 3% roztworu pikrynianu i odstawić w temp. 0oC na 30 min. Odwirować osad białek towarzyszących , po oziębieniu supernatantu w mieszaninie oziębiającej (lód z NaCl) dodać 3 objętości oziębionego acetonu. Po 15 min odwirować, osad na ściankach probówki przemyć oziębionym acetonem i eterem oraz rozpuścić w 100 cm3 wody.
b) 5 g drożdży rozetrzeć w moździerzu z piaskiem, dodać ok. 50 cm3 wody i ponownie dokładnie rozetrzeć i odwirować. Supernatant wlać do 5-krotnej objętości acetonu. Wytrącony osad rozpuścić w 20 cm3 wody i przesączyć. Przesącz zawierający enzym można przechowywać w lodówce kilka tygodni.
Zagadnienia do przygotowania:
1. Metody izolacji i oczyszczania enzymów.
2. Warunki niezbędne do uzyskania aktywnych enzymów.
3. Źródła enzymów stosowanych w technologii żywności.
Literatura:
1. Dziuba J., Kostyra H.: „Biochemia żywności (metody, zadania i testy)”, Wydawnictwo UW-M w Olsztynie, Olsztyn 2000.
2. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.): „Ćwiczenia z biochemii”, PWN Warszawa - Poznań 1982.
3. Kołakowski E., Bednarski W., Bielecki S. „Enzymatyczna modyfikacja składników żywności”, Akademia Rolnicza w Szczecinie, Szczecin 2005.
4. Stryer L.: „Biochemia”, PWN Warszawa 1986.
misiek.b