RÓŻNORODNOŚĆ CECH FENOTYPOWYCH BAKTERII KODOWANYCH PRZEZ PLAZMIDY.pdf

Tom 51, 2002

Numer 3 (256)

Strony 241–254

M IROS£AWA W £ODARCZYK

Zak³ad Genetyki Bakterii

Instytut Mikrobiologii

Uniwersytet Warszawski

Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa

miraw@biol.uw.edu.pl

RÓ¯NORODNOŒÆ CECH FENOTYPOWYCH BAKTERII KODOWANYCH PRZEZ

PLAZMIDY

W zale¿noœci od wielkoœci cz¹steczki, pla-

zmidy nios¹ geny koduj¹ce od kilku do kilkuset

ró¿nych bia³ek. Jednak¿e, jak ju¿ wspomnia³am

w poprzednim artykule, produkty genów o pla-

zmidowej lokalizacji nie s¹ niezbêdne do wzro-

stu komórki w standardowych (normalnych)

warunkach. Na plazmidach nie znajdziemy

wiêc genów koduj¹cych polimerazê RNA, pod-

jednostki rybosomów, enzymów cyklu Krebsa

itp. W rzadkich przypadkach, gdy na plazmi-

dzie stwierdzamy obecnoœæ tego typu genów,

lub gdy nie jesteœmy w stanie usun¹æ replikonu

uznawanego za plazmid z komórki, mamy pod-

stawy do podjêcia rozwa¿añ czy istotnie mamy

do czynienia z plazmidem, czy te¿ jest to repli-

kon niezbêdny do ¿ycia komórki, a wiêc chro-

mosom. Przypominam, ¿e od modelowej zasa-

dy, i¿ jedna komórka bakteryjna zawiera jeden

chromosom s¹ wyj¹tki; przyk³adem mog¹ byæ

niektóre gatunki Rhizobium i Paracoccus .

Geny o lokalizacji plazmidowej daj¹ bakteriom

selekcyjn¹ przewagê w pewnych specjalnych

warunkach, czêsto wrêcz umo¿liwiaj¹c im

prze¿ycie. Powstaje zatem pytanie, dlaczego

geny te nie s¹ po prostu czêœci¹ chromosomu,

tak aby wszystkie bakterie w sytuacjach niety-

powych mog³y odnosiæ korzyœæ z ich obecno-

œci. Dyskusja tego problemu zostanie podjêta

na koñcu artyku³u, po przedstawieniu

przegl¹du ró¿norodnoœci funkcji fenotypo-

wych kodowanych przez geny plazmidowe.

TYPY GENÓW OBECNYCH NA PLAZMIDACH

Wœród genów obecnych na plazmidach

mo¿emy wyró¿niæ dwa ich podstawowe typy.

Pierwszy, to geny absolutnie niezbêdne dla

funkcjonowania plazmidu jako autonomiczne-

go replikonu i obecne w ka¿dym plazmidzie, a

wiêc geny i sekwencje (np. oriV ), niezbêdne

do replikacji i stabilnego utrzymywania

cz¹steczki plazmidu w komórce. Drugi typ, to

wszystkie pozosta³e geny stanowi¹ce „dodat-

kowe wyposa¿enie” plazmidu, od których zale-

¿y ró¿norodnoœæ fenotypów kodowanych

przez plazmidy, lecz które nie s¹ niezbêdnym

elementem sk³adowym ka¿dego plazmidu. Na

Ryc. 1 w schematyczny sposób przedstawiono

z³o¿onoœæ struktury plazmidu, wyró¿niaj¹c w

obrêbie jego cz¹steczki kilka umownych mo-

du³ów strukturalno-funkcjonalnych (T HOMAS

2000).

Plazmid zawieraj¹cy tylko „modu³ replika-

cyjny”, bêdzie spe³nia³ kryteria definicji pla-

zmidu, lecz jego obecnoœæ nie bêdzie nadawa³a

komórce gospodarza ¿adnych specjalnych fe-

notypowych w³aœciwoœci odró¿niaj¹cych j¹ od

komórki bezplazmidowej. Bêdzie to wiêc pla-

zmid sensu stricto kryptyczny. Zwracam uwa-

gê, ¿e mianem plazmidu kryptycznego okreœla-

242

M IROS£AWA W £ODARCZYK

Rejon replikacyjny

Kolejny wyró¿niony zespó³ genów to geny

odpowiedzialne za horyzontalny transfer pla-

zmidów (autotransfer drog¹ koniugacji lub

transfer „wspomagany” obecnoœci¹ innego pla-

zmidu, tzw. mobilizuj¹cego). S¹ one bardzo wa-

¿ne dla mo¿liwoœci rozprzestrzeniania siê pla-

zmidów w œrodowisku, lecz ich brak nie powo-

duje zaburzeñ w funkcjonowaniu plazmidu w

komórce.

Modu³ zaznaczony na schemacie jako „se-

kwencje insercyjne” to okreœlenie umowne; se-

kwencje IS nie s¹ oczywiœcie zgrupowane w

jednej czêœci genomu plazmidowego, stanowi¹

jednak sk³adnik bardzo wa¿ny, odpowiedzial-

ny g³ównie za wszelkiego rodzaju przegrupo-

wania genów w obrêbie cz¹steczki plazmidu

oraz ich transfer miêdzy ró¿nymi replikonami

w komórce. Czêsto sekwencje IS ograniczaj¹

inne zespo³y genów (np. opornoœciowych)

tworz¹c du¿e, z³o¿one elementy mobilne,

transpozony. O istotnym znaczeniu sekwencji

insercyjnych w funkcjonowaniu i ewolucji pla-

zmidów œwiadczyæ mo¿e ich stosunkowo du¿a

(w porównaniu do chromosomów) zawartoœæ

w plazmidach (M AHILLON i wspó³aut. 1999).

Na schemacie najwiêkszy obszar zajmuje

modu³ grupuj¹cy geny zwi¹zane z ró¿nymi ce-

chami fenotypowmi gospodarza, zwykle meta-

boliczno-fizjologicznymi, wynikaj¹cymi z

obecnoœci plazmidu. W konkretnych plazmi-

dach takich genów mo¿e byæ ró¿na liczba, a

wielkoœæ obszaru tego modu³u ma raczej obra-

zowaæ ogólny ogromny zakres ró¿norodnoœci

tych cech. W ka¿dym plazmidzie wystêpuje

pewna frakcja sekwencji DNA, których funkcji

nie znamy, pozostaje to prawdziwe nawet w

odniesieniu do plazmidów o kompletnie po-

znanej sekwencji nukleotydowej. Ten obszar

oznaczono jako rejon „cichy” (ang. silent).

Rejon

“cichy”

Geny

zwi¹zane

z transferem

koniugacyjnym

Geny zwi¹zane

z warunkowanym

przez plazmid

fenotypem

Sekwencje

insercyjne

Ryc. 1. Typy genów wystêpuj¹ce w cz¹steczce

plazmidowej.

Rejon replikacyjny to modu³ absolutnie niezbêdny w

plazmidzie, pozosta³e grupy genów mog¹ lecz nie

musz¹ byæ obecne.

my te¿ zwyczajowo plazmid zidentyfikowany

poprzez wykrycie w komórce fizycznej obec-

noœci DNA plazmidowego, lecz którego obec-

noœci nie kojarzymy (na tym etapie analizy) z

okreœlon¹ cech¹ fenotypow¹ komórki gospo-

darza. Geny warunkuj¹ce replikacjê cz¹steczki

plazmidu s¹ zazwyczaj skupione na jednym

fragmencie DNA plazmidowego, który w du-

¿ych plazmidach stanowi niewielki procent

ca³ego genomu. Identyfikacja takiego fragmen-

tu i wyposa¿enie go w marker selekcyjny po-

zwala na konstrukcjê pochodnej plazmidu za-

wieraj¹cej tylko modu³ replikacyjny. Taki mini-

malny replikon jest niezwykle przydatny w mo-

lekularnej analizie systemu replikacyjnego pla-

zmidu macierzystego.

CECHY FENOTYPOWE BAKTERII DETERMINOWANE PRZEZ GENY PLAZMIDOWE

Cech takich jest niezwykle du¿o, dlatego

te¿ dla zwiêkszenia przejrzystoœci opisu w Ta-

beli 1 zgrupowano je w kilka powszechnie wy-

ró¿nianych typów, aby nastêpnie, na wybra-

nych przyk³adach omówiæ niektóre z nich bar-

dziej szczegó³owo.

bezpoœrednio „dotykaj¹ca” cz³owieka, by³a od

dawna i wci¹¿ jest przedmiotem bardzo inten-

sywnych badañ naukowców na ca³ym œwiecie.

Cecha lekoopornoœci jest te¿ fenotypem bakte-

rii najpowszechniej kojarzonym z obecnoœci¹

w nich plazmidów z grupy tzw. opornoœcio-

wych (plazmidy R), chocia¿ nale¿y pamiêtaæ,

¿e geny warunkuj¹ce opornoœæ bakterii na an-

tybiotyki mog¹ byæ te¿ zlokalizowane w chro-

mosomie komórki. Jednak opornoœæ kodowa-

na plazmidowo istotnie jest przedmiotem

szczególnego zainteresowania, co wynika z kil-

OPORNOŒÆ NA ANTYBIOTYKI I

CHEMIOTERAPEUTYKI

Cecha opornoœci bakterii, zw³aszcza choro-

botwórczych, na antybiotyki jako najbardziej

Ró¿norodnoœæ cech fenotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy

243

Tabela 1. Przyk³ady fenotypów zale¿nych od obecnoœci plazmidów

Fenotyp

Plazmid

Naturalny gospodarz

Opornoœæ na antybiotyki i inne leki

Tetracyklina

RP4

NR1

R6K

R938

R6K

pIP1527

pSa

Pseudomosnas aeruginosa

Shigella flexneri

Proteus rettgeri

Serratia marcescens

Proteus rettgeri

Escherichia coli

Shigella sp.

Streptomycyna

Chloramfenikol

Penicylina

Erytromycyna

Sulfamidy

Opornoœæ na jony metali ciê¿kich

Rtêæ

NR1(Tn21)

pI258

pMOL30

pRJ1004

R773

Shigella flexneri

Staphylococcus aureus

Ralstonia eutropha

Pseudomonas syringae

Escherichia coli

Kadm, cynk, kobalt

Miedï

Arsen

Produkcja antybiotyków i bakteriocyn

Metylenomycyna

Kolicyna E1

Kloacyna DF13

Megacyna BII

pSCP1

ColE1

CloDF13

pSE203

Streptomyces coelicolor

Escherichia coli

Enterobacter cloaceae

Bacillus megaterium

Katabolizm toksycznych zwi¹zków

Toluen

(inne przyk³ady — patrz Tabela 2)

TOL (pWWO)

Pseudomonas putida

Patogennoœæ bakterii

Produkcja hemolizyny

Czynnik wirulencji

Antygen kolonizacyjny

Adhezyna YadA

Wirulencja

pJH1

pX01

pK88

pYV

pMYSG6000

Streptococcus faecalis

Bacillus anthracis

Escherichia coli

Yersisnia spp .

Shigella flexneri 2a

Interakcje z roœlinami

Rakowate guzy roœlin

Kêdzierzawoœæ korzeni

Tworzenie brodawek korzeniowych

Wi¹zanie azotu

pTi

pRi

pPN1

pIJ1007

Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium rhizogenes

Rhizobium leguminosarum

Zdolnoœæ do koniugacji

RK2

NR1

pAD1

pSCP1

Escherichia coli

Klebsiella aerogenes

Shigella flexneri

Enterococcus fecalis

Streptomyces coelicolor

Inne w³aœciwoœci

Tworzenie pêcherzyków gazowych

Pigmentacja

Fermentacja laktozy

Wykorzystywanie sacharozy

pHH1

pPL376

pLM3601

CTnscr94

Halobacterium sp.

Erwinia herbicola

Streptococus cremoris

Salmonella senftenberg

ku powodów. Po pierwsze, bardzo czêsto pla-

zmidy nios¹ genetyczne determinanty oporno-

œci na wiêcej ni¿ jeden antybiotyk równocze-

œnie, co a priori stwarza utrudnienie w terapii,

po drugie, w naturalnych plazmidach oporno-

œciowych genetyczne determinanty opornoœci

244

M IROS£AWA W £ODARCZYK

na antybiotyki s¹ czêsto czêœci¹ sk³adow¹ ru-

chomych elementów genetycznych, transpo-

zonów. Ponadto plazmidy opornoœciowe s¹

zwykle zdolne do koniugacyjnego transferu

swego DNA. Wszystkie te cechy sprzyjaj¹ nie-

bezpiecznemu rozprzestrzenianiu siê cechy

opornoœci na antybiotyki w œrodowisku (tak¿e

szpitalnym!).

Poniewa¿ problemowi plazmidowo kodo-

wanej opornoœci na antybiotyki poœwiêcony

jest oddzielny artyku³ (patrz art. J. P ORTYKUS w

tym zeszycie KOSMOSU), w tym miejscu po-

przestanê na podkreœleniu kilku wa¿nych ogól-

nych aspektów tego zagadnienia. Najogólniej

mówi¹c antybiotyki mo¿na podzieliæ na kilka

kategorii w zale¿noœci od mechanizmu ich

dzia³ania: takie które (i) oddzia³uj¹ na syntezê

œciany komórkowej bakterii ( -laktamy), (ii)

naruszaj¹ce integralnoœæ b³ony cytoplazma-

tycznej (polimyksyna), (iii) hamuj¹ce metabo-

lizm kwasów nukleinowych (kwas nalidykso-

wy, aktynomycyna D) lub (iv) hamuj¹ce synte-

zê bia³ek (chloramfenikol, streptomycyna).

Bakterie wykszta³ci³y szlaki opornoœci tak ró¿-

norodne, ¿e potrafi¹ one zapobiec skuteczne-

mu dzia³aniu ka¿dego z wymienionych mecha-

nizmów. Opornoœæ na antybiotyk wynikaæ

mo¿e na przyk³ad z: (i) detoksyfikacji lub inak-

tywacji antybiotyku, (ii) zmniejszenia poziomu

pobierania antybiotyku lub jego aktywne usu-

wanie z komórki, (iii) nadprodukcji komórko-

wego celu dzia³ania antybiotyku (tzw. tarczy),

lub z jej modyfikacji, (iv) wytworzenia zastêp-

czego wobec zahamowanego przez antybiotyk

kompletnego szlaku metabolicznego lub tylko

jego zablokowanego etapu, czyli tzw. mecha-

nizm „bypass”. Tylko niektóre z dróg zyskiwa-

nia opornoœci na antybiotyk mog¹ wynikaæ z

pojedynczej mutacji istniej¹cego w komórce

genu. W wiêkszoœci przypadków wymagane

jest uzyskanie nowego genu (lub kilku genów),

genów te pochodz¹ od mikroorganizmów pro-

dukuj¹cych antybiotyki, u których stanowi¹

one naturalne zabezpieczenie przed zabój-

czym dzia³aniem w³asnego metabolitu.

OPORNOŒÆ NA JONY METALI CIÊ¯KICH

Obecnoœæ w œrodowisku kationów metali

ciê¿kich (rtêci, niklu, o³owiu, kadmu, bizmutu,

antymonu czy srebra) oraz niektórych anio-

nów (arsenianów, boranów, chromianów) nie

jest rzadka w okolicach uprzemys³owionych.

S¹ to zwi¹zki wysoce toksyczne dla wszystkich

organizmów ¿ywych, tak¿e dla wiêkszoœci bak-

terii. Jednak z gleb i wód zanieczyszczonych

tymi zwi¹zkami izolowane s¹ bakterie oporne

na ich dzia³anie, a najczêœciej opornoœæ ta wa-

runkowana jest obecnoœci¹ plazmidów. W wie-

lu przypadkach mechanizmy opornoœci na

jony metali ciê¿kich zosta³y poznane bardzo

dok³adnie. Szczególnie ciekawy jest system ge-

netyczny warunkuj¹cy opornoœæ bakterii na

jony Hg 2+ oraz organiczne zwi¹zki rtêci. Enzy-

my uczestnicz¹ce w detoksyfikacji tych

zwi¹zków tworz¹ tzw. operon mer i s¹ najczê-

œciej zlokalizowane na transpozonach (najle-

piej poznane to Tn 501 z Pseudomonas aerugi-

nosa iTn 21 z plazmidu NR1 Shigella flexneri ).

Najistotniejsz¹ cech¹ mechanizmu opornoœci

bakterii na jony rtêci jest wytworzenie wysoce

specyficznego systemu transportu zwi¹zków

rtêci do wnêtrza komórki, gdzie s¹ one, z

udzia³em reduktazy rtêcianowej, prze-

kszta³cane w mniej toksyczn¹ i lotn¹ formê

Hg 0 . W przypadku organicznych zwi¹zków rtê-

ci, system wyposa¿ony jest w dodatkowy en-

zym, liazê, uwalniaj¹cy rtêæ w formie jonowej

przed jej redukcj¹ do formy Hg 0 (M ISRA 1992).

Genetyczna organizacja operonu mer pokaza-

na jest na Ryc. 2.

merR

OP merT merP

merA

merD

Ryc.2. Genetyczna organizacja operonu mer (Tn 501 ) warunkuj¹cego opornoœæ na jony rtêci.

Geny merT i merA odpowiadaj¹ za transport jonów Hg 2+ do wnêtrza komórki, gen merA koduje reduktazê rtêcia-

now¹, a geny merR i merD pe³ni¹ funkcje regulacyjne, OP — to rejon operatora i promotora.

co, podobnie jak w sytuacji pojawiania siê wie-

lorakiej opornoœci jest najczêœciej zwi¹zane z

wprowadzeniem do komórki plazmidu opor-

noœciowego. Oczywiœcie nie wyjaœnia to „pier-

wotnego” Ÿród³a genów determinuj¹cych

opornoœci niesionych przez plazmid. Aktual-

nie powszechnie akceptowana jest hipoteza, i¿

Na ca³kowicie innych zasadach opiera siê

mechanizm opornoœci na Ca 2+ ,Co 2+ iZn 2+

(N IES 1992). W tym przypadku, obecne w œro-

dowisku toksyczne jony wnikaj¹ do wnêtrza

komórki niespecyficznie lub przez systemy

transportuj¹ce jony Mg 2+ . Je¿eli w komórce

obecny jest jeden z plazmidów koduj¹cych

Ró¿norodnoœæ cech fenotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy

245

tzw. system CZC, to jony które wniknê³y do ko-

mórki ulegaj¹ specyficznemu transportowi na

zewn¹trz. Jednym z najdok³adniej scharaktery-

zowanych plazmidów odpowiedzialnych za

opornoœæ bakterii na jony kadmu, kobaltu i

cynku jest bardzo du¿y (238 kb) plazmid

pMOL30 zidentyfikowany w Ralstonia eu-

tropha (M ERGEAY i wspó³aut. 1985). Rycina 3

ilustruje zasadê opornoœci tej bakterii na jony

kadmu, cynku i kobaltu warunkowan¹ obecno-

œci¹ plazmidu pMOL30.

kontrol¹ genetyczn¹ genów zlokalizowanych

na plazmidach, które jednoczeœnie nios¹ gene-

tyczne determinanty opornoœci (ang. immuni-

ty) producenta na dzia³anie obecnej w œrodo-

wisku bakteriocyny (B AREFOOT i wspó³aut.

1992, J OERGER i wspó³aut. 2000). Pod wzglê-

dem chemicznym bakteriocyny to substancje

bia³kowe o masie 20–90 kDa, chocia¿ znane s¹

te¿ tzw. mikrocyny o masie <1 kDa. Mechanizm

dzia³ania bakteriocyn na komórki obejmuje za-

burzenia struktury i funkcji membran, tzw. de-

polaryzacjê (np. kolicyna E1), uszkodzenia

DNA (np. kolicyna E2 dzia³aj¹ca jako niespecy-

ficzna endonukleza), lub hamowanie syntezy

bia³ek poprzez inaktywacjê rybosomowego

RNA (kolicyna E3 i kloacyna DF13). Bakterio-

cyny, jako substancje antybakteryjne o bardzo

w¹skim (w odró¿nieniu od „prawdziwych” an-

tybiotyków) spektrum dzia³ania, nie znalaz³y

szerszego zastosowania praktycznego. Zasad-

niczo jedynie produkowana przez Lactococcus

lactis nizyna (która jest jednak kodowana

przez geny chromosomowe) znalaz³a prawnie

usankcjonowanie zastosowanie jako konser-

want ¿ywnoœci. Próby stosowania bakteriocyn

w medycynie weterynarii s¹ wci¹¿ w stadium

niezbyt zaawansowanym.

Systemy genetyczne determinuj¹ce pro-

dukcjê bakteriocyn (np. kolicyny E1 kodowa-

nej przez plazmid ColE1 czy kloacyny kodowa-

nej przez plazmid CloDF13) s¹ jednak niezwy-

kle ciekawe w swojej organizacji i regulacji i

choæby z tego powodu wzbudzaj¹ du¿e zainte-

resowanie badaczy (L URIA iS UIT 1992). Zespó³

genów stanowi¹cych „kasetê kolicynow¹” pla-

zmidu ColE1 przedstawiony jest na Ryc. 4. Cie-

kaw¹ cech¹ systemu jest to, ¿e wytwarzanie ko-

licyny jest zabójcze dla producenta, gdy¿ uwol-

nienie produktu genu cea do œrodowiska

zwi¹zane jest z liz¹ komórki przy udziale pro-

duktu genu kil . Jednak ca³y ten zlokalizowany

na plazmidzie system jest w stanie represji wy-

nikaj¹cej z zablokowania g³ównego promotora

(P col ) przez komórkowe bia³ko LexA, i prak-

tycznie w populacji nie wiêcej ni¿ 10 -3 komó-

rek na generacjê produkuje aktywnie kolicynê

i w wyniku „samobójczego aktu” wydziela j¹ do

œrodowiska. Komórki nie produkuj¹ce aktual-

nie kolicyny, lecz nios¹ce plazmid ColE1, s¹

chronione przed dzia³aniem egzogennej koli-

cyny dziêki funkcji produktu genu imm, (ule-

gaj¹cemu ekspresji tak¿e z w³asnego promoto-

ra, patrz Ryc. 4), natomiast eliminacji ze œrodo-

wiska ulegaj¹ pokrewne bakterie bezplazmido-

we. Wszelkie sytuacje powoduj¹ce zniszczenie

Co Zn Cd

2 +

Mg 2 +

2 +

plazmid

pMOL30

2 +

Co Zn Cd

CzcD

CzcABC

Co Zn Cd

2 + 2 +

Ryc. 3. System opornoœci Ralstonia eutropha na

kobalt, cynk i kadm warunkowanej przez

pMOL30. Zasady funkcjonowania — w tekœcie.

Czytelników zainteresowanych problema-

mi plazmidowo kodowanej opornoœci na sole

metali ciê¿kich odsy³am do poœwiêconego

temu tematowi ca³ego numeru specjalistyczne-

go czasopisma „Plasmid” 1/1992 oraz do arty-

ku³ów przegl¹dowych (S ILVER iM ISRA 1988,

S ILVER 1996, S ILVER iP HUNG 1996).

PRODUKCJA BAKTERIOCYN

Zdolnoœæ pewnych bakterii do produkcji

antybakteryjnych czynników zdolnych do zabi-

jania jedynie szczepów blisko spokrewnio-

nych, lecz niezdolnych do produkcji tych¿e

czynników opisana zosta³a ju¿ w 1925 r. przez

belgijskiego mikrobiologa Andre Gratia jako

tzw. „principle V” (ang. virulence, gdy¿ produ-

cent tego czynnika by³ jednoczeœnie wirulent-

ny w stosunku do œwiñ). Czynniki te okreœlane

obecnie ogólnie mianem bakteriocyn (lub koli-

cyn, je¿eli producentami s¹ szczepy Escheri-

chia coli ) syntetyzowane s¹ najczêœciej pod

2 +

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: