TECHNIKA WESTERN BLOT.pdf
(
269 KB
)
Pobierz
282189908 UNPDF
TECHNIKA WESTERN BLOT
http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab3.html
TECHIKA WESTER BLOT
(białkoprzeciwciało) wiązanie przeciwciała w celu identyfikacji określonego białka.
Etapy :
1. Przygotowanie ekstraktów komórkowych.
Metody stosowane przy izolacji i oczyszczaniu białek są bardzo różnorodne a ich
wybór zależy od właściwości danego białka.
2. Rozdział białek w żelach poliakrylamidowych. W zależności od zastosowanego
układu można uzyskać rozdział polipeptydów stosownie do różnych właściwości
fizykochemicznych. Przyjmuje się , że
elektroforeza
w obecności SDS
(dodecylosiarczan sodowy) detergent frakcjonuje białka zależnie od ich masy czyli
zarazem długości łańcucha polipeptydowego. Eliminuje efekt różnicowania pod
1 z 3
2010-04-04 13:27
TECHNIKA WESTERN BLOT
http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab3.html
względem kształtu. SDS powoduje denaturację białka , dysocjację podjednostek
(rozbija wiązania niekowalencyjne) i opłaszczenie. Około1,4 gr SDS wiąże się z 1 gr
białka. Ten typ
elektroforezy
jest najczęściej stosowany i może być użyty jako
metoda analityczna lub stanowić element szeregu dalszych badań. Złożem , w którym
następuje rozdział jest żel poliakrylamidowy. Z reguły do rozdziału białek używana
jest szczególna wersja
elektroforezy
tzw. elektroforeza nieciągła , która umożliwia
maksymalne wykorzystanie zdolności rozdzielczych tej metody. W praktyce oznacza
to , że zarówno żel składa się jakby z dwóch warstw (żel rozdzielający i zatężający
różniące się składem procentowym) jak również bufor do
elektroforezy
inny jest w
górnym inny w dolnym zbiorniku aparatu do
elektroforezy
. Próbki nakładane na żel
mogą mieć stosunkowo dużą objętość ponieważ w czasie przechodzenia przez górną
warstwę żelu zostają zagęszczone do wąskiego pasma aby w dolnym żelu ulec
rozdzieleniu na pojedyncze , ostre prążki. Dzięki temu , że frakcjonowanie zachodzi w
zależności od długości łańcucha polipeptydowego jesteśmy w stanie ustalić masę
cząsteczkową danego białka przez porównywanie z odpowiednimi standardami o
znanych masach , z dokładnością do 510%.
3. Renaturacja.
Inkubacja z odpowiednim buforem.
4. Transfer białek z żelu na membranę nitrocelulozową.
Z reguły elektrotransfer.
5. Immunoblotting.
Jednym z niebezpieczeństw jest to , że białka zaadsorbowane do nitrocelulozy mogą
mieć nieco zmieniony układ przestrzenny
aminokwasów
a ponieważ rozdzielane są w
żelu w formie zdenaturowanej a następnie muszą ulec renaturacji , mogą w ogóle nie
przyjmować swojej natywnej postaci.
a. Zablokowanie miejsc niespecyficznych.
b. Inkubacja ze specyficznymi dla poszukiwanego białka przeciwciałami.
c. Inkubacja z odczynnikiem używanym do detekcji.
Najczęściej są to II (drugorzędowe) przeciwciała czyli przeciwciała , dla których
antygenem jest przeciwciało specyficzne. II przeciwciała związane są z barwnikami
fluorescencyjnymi , cząstkami złota lub enzymami. Systemy detekcyjne muszą być
proste i czułe. Można wykryć za ich pomocą nawet 10
-9
do 10
-12
gr białka. II
przeciwciała mogą być skoniugowane z enzymem , który zmienia kolor substratu
podczas reakcji np. z AP alkaliczną fosfatazą (w zależności od użytego substratu
utworzony związek jest ciemno niebieski lub purpurowy) lub z HRP peroksydazą
szczurzą (utlenienie odpowiednich substratów prowadzi do powstawania ciemnego
strątu w miejscu reakcji). Innym systemem detekcji jest awidyna lub streptawidyna
skoniugowana z enzymem (AP lub HRP). Awidyna i streptawidyna silnie wiążą się z
biotyną. I przeciwciała znakuje się biotyną a zamiast II przeciwciał do detekcji używa
się awidyny lub streptawidyny skoniugowanej z enzymem. Ponieważ jedna
cząsteczka awidyny lub streptawidyny związana jest z kilkoma cząsteczkami enzymu
system detekcji jest bardziej czuły niż w przypadku użycia przeciwciał.
Następny system to tzw. system NIP. Stworzony aby ograniczyć ilość
niespecyficznych reakcji II przeciwciał. I przeciwciała znakuje się nitrojodofenolem
(NIP) , II przeciwciała skoniugowane z enzymem są skierowane przeciwko NIP.
Ponieważ NIP jest związkiem drobnocząsteczkowym reakcja przeciwciał jest bardzo
specyficzna. Kolejny rodzaj to systemy nieenzymatyczne. Na przykład II przeciwciała
2 z 3
2010-04-04 13:27
TECHNIKA WESTERN BLOT
http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab3.html
wyznakowane koloidalnym złotem lub radioaktywnie (
125
I). W pierwszym przypadku
uzyskuje się bezpośrednie uwidocznienie reakcji , w drugim detekcja wymaga
autoradiografii.
TECHNIKA NORTHERN
ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU
(c) 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie
Webmaster
3 z 3
2010-04-04 13:27
Plik z chomika:
michalak.daria
Inne pliki z tego folderu:
Zastosowanie genetyki w hodowli, rolnictwie i medycynie.docx
(16 KB)
Perspektywy rozwoju genetyki.docx
(19 KB)
transkrypcja - regulacja.pdf
(3175 KB)
transkrypcja.pdf
(3038 KB)
Histologia i fizjologia macierzy.pdf
(1266 KB)
Inne foldery tego chomika:
biomechanika
Bobath
Ćwiczenia
Czerwiec 2010
Danielle Steel Książki
Zgłoś jeśli
naruszono regulamin