Hybrydyzacja kwasów nukleinowych – zjawisko spontanicznego łączenia się komplementarnych nici kwasów nukleinowych (DNA z DNA, RNA z RNA lub DNA z RNA). Komplementarne nici kwasów nukleinowych ulegają rozdzieleniu (tzw. denaturacji) pod wpływem wysokiej temperatury lub substancji chemicznych, takich jak formamid lub mocznik. Po usunięciu wpływu czynnika denaturującego, nici łączą się ponownie (renaturacja). Szybkość hybrydyzacji zależy między innymi od długości fragmentów kwasów nukleinowych, podobieństwa i różnorodności sekwencji w próbce poddanej hybrydyzacji.
Zjawisko hybrydyzacji znalazło szereg użytecznych zastosowań w technikach biologii molekularnej. W szczególności, hybrydyzacji z użyciem znakowanego izotopowo lub chemicznie fragmentu kwasu nukleinowego (tzw. sondy molekularnej) używa się do detekcji homologicznych fragmentów podczas:
· poszukiwania nowych genów poprzez proces (klonowania genów), w przeszukiwaniu bibliotek genowych lub klonowaniu pozycyjnym.
· do oszacowania poziomu ekspresji genów poprzez specyficzną detekcję cząsteczek mRNA w technice northern.
· do globalnej analizy różnic w ekspresji genów pomiędzy dwiema próbkami z wykorzystaniem macierzy genowych.
· do wizualizacji regionów ekspresji genu w organizmie w technice hybrydyzacji in situ.
· do detekcji specyficznych fragmentów DNA w technice Southerna, np. w celu ustalenia ilości kopii danego genu w genomie, ustalenia wzoru polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP). Techniki RFLP używa się m.in. celu ustalenia ojcostwa.
W przeszłości prędkość hybrydyzacji DNA wyizolowanego z genomów dwóch różnych organizmów była używana jako miara pokrewieństwa ewolucyjnego. W ten sposób na przykład ustalono po raz pierwszy, że szympans jest najbliższym ewolucyjnie krewniakiem człowieka
Hybrydyzacja metodą Southerna (ang. Southern blotting, Southern blot) to metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca wykrywaniu określonych fragmentów DNA . Jej nazwa pochodzi od nazwiska E. Southerna, który ją opisał i przedstawił w roku 1975[1].
Aby ją wykonać, należy przeprowadzić elektroforetyczne rozdzielenie mieszaniny fragmentów DNA (np. po cięciu enzymami restrykcyjnymi), umieścić w alkalicznym buforze, który wywoła denaturację DNA. Następnie całość przenosi się na błonę nylonową. Po odpowiednim spreparowaniu błony nylonowej z DNA wykonuje się hybrydyzację z sondą, a następnie przy pomocy odpowiedniej metody detekcji uwidacznia się interesujące nas fragmenty DNA. Metoda ta może być przeprowadzona w sposób pozwalający określić ilość DNA w badanej próbce. Wówczas siłę sygnału przekłada się na poziom DNA obecnego w badanej próbce.
Hybrydyzację Southerna można stosować m.in. po cięciu DNA enzymami restrykcyjnymi, po reakcji PCR z użyciem mało specyficznych starterów (zobacz: reakcja łańcuchowa polimerazy) lub też w celu wykrycia obcego DNA w badanym organizmie (np. DNA wirusa u człowieka).
Hybrydyzacja northern (ang. northern blotting) to metoda stosowana w biologii molekularnej, służąca do detekcji określonych sekwencji RNA. Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA genów ulegających transkrypcji w komórce.
Metodyka jest zbliżona do hybrydyzacji Southerna: (skąd też pochodzi nazwa metody, patrz niżej)
· RNA poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu (elektroforezie) na żelu
· po rozdziale RNA przenosi się na odpowiednią membranę oraz utrwala na niej
· membranę z RNA inkubuje się z sondą, tzn. cząsteczką DNA lub RNA, która po pierwsze jest komplementarna do poszukiwanej sekwencji, a po drugie daje się łatwo wykryć
· po inkubacji i odpłukaniu nadmiaru sondy przeprowadza się detekcję, czyli uwidacznianie sondy, która związała się do poszukiwanej sekwencji RNA na membranie.
Jeżeli nie interesuje nas długość wykrywanego RNA, krok pierwszy (elektroforezę) można pominąć. Wówczas RNA nanosi się bezpośrednio na membranę.
Sonda daje na ogół sygnał proporcjonalny do ilości RNA obecnego na membranie, stąd po intensywności sygnału po detekcji można ilościowo oszacować poziom wykrytego RNA.
Nazwa metody powstała jako gra słów z nazwą wcześniej znanej metody wykrywania określonych sekwencji kwasów deoksyrybonukleinowych – hybrydyzacją Southerna[1] (która została opracowana przez brytyjskiego biologa molekularnego Edwina Southerna).
Szlak RecBCD
RecA promuje wymiane nici miedzy czasteczkami DNA gdy:
(i) jedna z czasteczek ma region ssDNA, do
ktorego mo>e sie wiazac recA
(ii) dwie czasteczki wykazuja co najmniej 50 pz
region niemal identycznej homologii
(iii) w obrebie rejonu homologii musi istniec wolny
koniec DNA, ktory inicjuje wymiane nici
Rybosomy bakterii i eukariontów
Rybosomy bakterii są mniejsze i wrażliwsze na inne toksyny niż ich eukariotyczne odpowiedniki (te różnice są wykorzystywane przez niektóre antybiotyki)
U prokariotów występują rybosomy 70S. Duża podjednostka (50S) zawiera 34 białka i dwie cząsteczki rRNA (5S rRNA i 23S rRNA), a mała podjednostka (30S) zawiera 21 białek i jedną cząsteczkę rRNA (16S rRNA).
U eukariontów występują rybosomy 80S oraz mniejsze rybosomy mitochondrialne i chloroplastowe przypominające rybosomy bakteryjne. Rybosomy 80S są zbudowane z dużej podjednostki (60S), która składa się z trzech cząsteczek rRNA (5S, 5.8S i 28S rRNA) oraz 49 białek, oraz małej podjednostki (40S), która składa się z 33 białek i jednej cząsteczki rRNA (18S rRNA).
Rybosomy chloroplastowe i mitochondrialne Przypominają rybosomy bakteryjne, co wspiera teorię endosymbiotyczną
U eukariontów można wyróżnić dwie lokalizacje rybosomów
· rybosomy wolne - swobodnie pływające w cytoplazmie (służą one do syntezy białek nieeksportowanych poza komórkę, takich jak enzymy wewnątrzkomórkowe, białkowe elementy błon komórkowych, białka wędrujące do jądra, białka cytoplazmy czy białka cytoszkieletu. Do tej klasy można zaliczyć także rybosomy w organellach: mitochondrium lub chloroplaście;
· rybosomy związane z błoną - lub przyczepione do retikulum endoplazmatycznego (szorstkiej siateczki śródplazmatycznej), w których następuje synteza białek eksportowanych transportowanych przez siateczkę śródplazmatyczną także poza błony komórki - hormony białkowe, kolagen, białka wydzielnicze, enzymy lizosomalne, białka wchodzące w skład błon, nici elastynowe dla tkanki łącznej).
Chaperony (Szaperony, Bialka opiekuńcze) - białka oddziałujące z fałdującym się białkiem, zapobiegające nieprawidłowym wiązaniom i eliminujące błędne struktury.
Chaperony wiążą się w sposób odwracalny z nie pofałdowanym odcinkiem polipeptydu, który w innym przypadku mógłby służyć jako ośrodek agregacji lub błędnego fałdowania. Chaperony wiążą się z częściowo zwiniętymi łańcuchami umożliwiając im kontynuację zwijania się w sposób najbardziej korzystny energetycznie. Pomagają białkom w uporządkowanym tworzeniu ich struktury przestrzennej. Jedna z rodzin chaperonów nazywana jest białkami szoku cieplnego. Należą do tej rodziny min Hsp60, Hsp70, BiP, GRP75, Hsp83, Grp94.
Spliceosom - kompleks białek i RNA, który bierze udział w wycinaniu intronów z pre-mRNA w procesie splicingu. Znane są dwa rodzaje spliceosomu. W skład klasycznego spliceosomu wchodzi pięć małych jądrowych nukleoprotein (snRNP, czyli białko + snRNA), zwanych U1, U2, U4, U5 i U6. Wycina on introny mające sekwencję GU na 5'-końcu i AG na 3'-końcu. Spliceosom alternatywny (typu U12) wycina introny zaczynające się od AU i kończące się AC. Również zawiera pięć rodzajów snRNP. Są to U11, U12, U4atac, U6atac, oraz - tak samo jak w spliceosomie klasycznym - U5.
Klasyczny spliceosom ma masę 12 MDa, z czego snRNA stanowią 3,3 MDa, a współtworzące snRNP białka - 2,2 MDa, co stanowi prawie połowę kompleksu. Ponadto spliceosom tworzą tzw. czynniki splicingu (~70) oraz inne białka (~30) niezbędne do związania RNA podlegającego splicingowi i katalizy procesu.
chuiqita