Transformacja bakterii Escherichia coli.

Część teoretyczna:

Transformacja

Ten sposób przekazywania genów między bakteriami został wykryty jako pierwszy i ma olbrzymie znaczenie. Transformację odkrył w 1928 roku Griffith obserwując zmiany w obrębie szczepu Streptococcus pneumoniae z formy R (niezjadliwej) w formę S (zjadliwą).Wyjaśnienei zjawiska transformacji dostarczyło pierwszego dowodu na to, że nośnikiem materiału dziedzicznego jest DNA (Avery O.T., MacLeod C.M., McCarty M., 1944). W wyniku transformacji komórki nabywają nowe cechy, które mogą zostać przekazane komórkom potomnym. Transformacja nie wymaga bezpośredniego kontaktu dwóch komórek ani pośrednictwa faga.

Zdolności transformujące posiada:

·         dwuniciowy, natywny DNA

·         plazmidowy DNA

Najwyższą częstość transformacji genomowym DNA uzyskuje się w obrębie gatunku. Transformacja międzygatunkowa zachodzi rzadko i głównie pomiędzy gatunkami pokrewnymi.

Do transformacji zdolne są komórki po osiągnięciu stanu kompetencji, czyli stanu, kiedy następują zmiany w budowie ściany komórkowej polegające na zwiększeniu jej „przepuszczalności” w wyniku, czego błona cytoplazmatyczna styka się bezpośrednio ze środowiskiem.

Transformacja naturalna

Niektóre bakterie mają naturalną zdolność do osiągania stanu kompetencji, np. Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus, Acinetobacter, Azotobacter, Synechococcus.

Transformacja indukowana:

a.       indukcja kompetencji przez specjalne, przedtransformacyjne zabiegi, np.u Escherichia coli można wymusić stan kompetencji poprzez traktowanie komórek CaCl2 (jony Ca2+ zwiększają przepuszczalność ściany komórkowej) w niskiej temperaturze.

b.      elektroporacja – polega na zadziałaniu prądem o wysokim napięciu, który powoduje czasowe tworzenie się porów w błonie komórkowej co ułatwia wnikanie DNA. Można używać do transformacji komórek gramdodatnich i gramujemnych.

c.       protoplastyzacja komórek – stosuje się głównie w bakteriach gramdodatnich np. Bacillus, Streptomyces. Protoplasty (komórki pozbawione ściany komórkowej) uzyskuje się poprzez potraktowanie np. polietylenoglikolem.

d.      balistyka (metoda tzw. „armatki genowej”) – stosuje się głownie do transformacji roślin. Polega na wstrzeliwaniu drobnych kuleczek wolframowych lub złotych opłaszczonych DNA.

Etapy transformacji:

1.      Wejście komórki w stan kompetencji

2.      Adsorpcja DNA na powierzchni komórki, początkowo nietrwała, wówczas DNA może być wymyty a następnie osiąga trwały kontakt

3.      Penetracja, wnikanie DNA do komórki, co wymaga nakładu energii

4.      Eklispy (=utajenia), kiedy DNA poszukuje miejsca homologii do chromosomu bakteryjnego

5.      Synapsis (=kojarzenie, parowanie) – wbudowanie egzogennego genomowego DNA  do genomu poprzez rekombinację lub doreplikowanie drugiej nici DNA w przypadku transformacji plazmidowym DNA

6.      Powstanie trwałego transformanta z nowymi cechami, które przekazywane są potomstwu

Losy transformanta zależą od tego, czy wprowadzony jest episom (wówczas namnaża się niezależnie od genomu gospodarza), inaczej musi dojść do podwójnej rekombinacji, by DNA włączył się do chromosomu gospodarza, w przeciwnym razie DNA jest gubiony w czasie podziału komórki.

Mechanizm transformacji nie jest jeszcze dokładnie poznany.

Mechanizm transformacji.

a) Komórki wytwarzają białkowy czynnik kompetencji (jego ilość zmienia się w czasie wzrostu bakterii), wchodzi on w reakcję z receptorem błonowym, który po aktywacji wysyła sygnał do chromosowego DNA i umożliwia ekspresję genów kompetencji, których produktami są różne białka np. autolizyny, które ułatwiają ekspozycję nukleaz i białek wiążących DNA na powierzchni komórki.

b) Dwuniciowe fragmenty DNA są adsorbowane na powierzchni komórki za pomocą białek wiążących. Nukleazy degradują jedną nić DNA, druga łączy się z białkami stanu kompetencji i zostaje wprowadzona do wnętrza komórki. Obce genomowe DNA odszukuje homologiczny odcinek w genomie gospodarza i w procesie rekombinacji (podwójny c-o) dochodzi do wymiany pojedynczych nici DNA.

Wydajność transformacji zależy od wielu czynników:

1. użytego szczepu bakterii
2. fazy wzrostu komórek
3. liczby komórek kompetentnych biorcy
4. stopnia pokrewieństwa (maleje wraz z malejącym stopniem pokrewieństwa)
5. czasu inkubacji DNA z komórkami kompetentnymi
6. stężenia i wielkości DNA (zależność jest liniowa, przekroczenie dawki nasycenia nie powoduje wzrostu liczby transformantów)
7. rodzaju DNA plazmidowego (najwyższa wydajność dla formy ccc, najniższa dla formy liniowej)
8. odpowiedniej temperatury
9. czasu trwania szoku termicznego
10. czystości odczynników i szkła
11. jakości pożywki, na którą wysiewane są transformanty

Opracowanie: dr Ewa Maciaszczyk

Część praktyczna:

1. Odczyt wyników koniugacji bakterii Escherichia coli. Obliczenie wydajności koniugacji wg wzoru:

                                                 ilość koniugantów

wydajność koniugacji  =                                                                        x  100%

                                                ilość komórek biorcy (lub dawcy)

2.      Rozwiązywanie zadań: 68-71, 73-77.

3.      Transformacja komórek bakterii Escherichia coli

Szczep E. coli:

JM109  AmpS (ukompetentniane RbCl)

Wprowadzany plazmid:

pFL38 (CEN, AmpR, URA3)

Przebieg doświadczenia:

1.      Do 50 ml komórek chemicznie kompetentnych bakterii dodać DNA plazmidowego :              

0 ml

2 ml

6 ml

10 ml

i dokładnie wymieszać.

2.      Zawiesinę inkubować w lodzie przez 30 min, po czym zastosować szok termiczny poprzez przeniesienie komórek do 42°C/5min.

3.      Komórki schłodzić w lodzie przez 2 min., po czym dodać 800 ml pożywki SOC.

4.      Zawiesinę komórek inkubować w temp. 37°C/45min.

5.      Zawiesinę komórek zwirować przez 1 min przy prędkości 12000 obr/min, odrzucić supernatant i osad komórek zawiesić w pozostałej w probówce pożywce

6.      Wysiać na płytkę LB z dodatkiem ampicyliny (100 mg/ml)

Materiały:

Podłoże SOB - 2% tryptofan, 0,5 % wyciąg drożdżowy, 0,5% NaCl, 0,2% KCl, pH 7,0

Pożywkę jałowiono w autoklawie i po ostudzeniu dodawano 10mM MgCl2 i 10mM MgSO4 otrzymując pożywkę SOC.

Podłoże LB – uniwersalne podłoże pełne dla bakterii

1