Mukowiscydoza.doc

1. WSTĘP

Mukowiscydoza (Mucoviscidosis, cystic fibrosis, torbielowate zwłóknienie trzustki) jest wieloukładową chorobą dzieci i dorosłych, klinicznie charakteryzującą się przewlekłymi zmianami obturacyjnymi i zakażeniami dróg oddechowych oraz zaburzeniami procesów trawienia wraz z ich konsekwencjami. Dysfunkcja gruczołów wydzielania zewnętrznego jest dominującym czynnikiem patogenetycznym odpowiedzialnym za bogatą symptomatologię kliniczną choroby. Wśród osób należących do rasy białej jest ona najczęstszą z chorób uwarunkowanych genetycznie.

Mukowiscydoza jest jednym z ważniejszych problemów pediatrycznych, stanowiąc częstą przyczynę ciężkich i przewlekłych zmian w układzie oddechowym, niewydolności zewnątrzwydzielniczej trzustki, polipowatości błony śluzowej nosa, zapaleń zatok obocznych nosa, wypadania błony śluzowej odbytu, zaburzeń odżywiania, czasami marskości wątroby i innych form dysfunkcji tego narządu.

Częstość występowania mukowiscydozy, ciężki, przewlekły przebieg ograniczający istotnie czas przeżycia, oraz konieczność stosowania wielospecjalistycznego i kosztownego leczenia określają społeczne znaczenie choroby. Szczególnego charakteru chorobie nadaje fakt, że rozpoznanie mukowiscydozy u dziecka jest jednoznaczne z rozpoznaniem rodziny wysokiego ryzyka genetycznego.

Częstość występowania mukowiscydozy w Polsce oceniana jest na 1:2300 żywo urodzonych. Chorobą tą dotknięte są zarówno noworodki, niemowlęta, dzieci starsze, jak i dorośli. Długość przeżycia, jak i jakość życia pacjentów w dużej mierze zależą od wczesnego rozpoznania i prawidłowego leczenia. Mimo znacznego postępu konwencjonalnych metod terapii, średnia długość życia chorych nie przekracza 30 roku życia.

Przy częstości urodzeń 400 000, w Polsce rocznie rodzi się około 200 dzieci dotkniętych tą chorobą. Około dwóch milionów Polaków, w równym stopniu mężczyzn i kobiet, jest nosicielami zmutowanego genu CFTR. Polski Rejestr Mukowiscydozy, prowadzony w Instytucie Gruźlicy i Chorób Płuc (Zespół Pediatryczny im Jana i Ireny Rudników w Rabce), w 1998 zawierał informacje o 899 żyjących chorych z mukowiscydozą.

2. DZIEDZICZENIE MUKOWISCYDOZY

Mukowiscydoza jest chorobą monogenową i dziedziczy się jako cecha autosomalna recesywna. Rozpoznanie choroby u dziecka oznacza, że jego rodzice są nosicielami zmutowanego genu. Sami nie wykazując cech klinicznych choroby mogą przekazywać zmutowany gen swojemu potomstwu. W takim związku szansa urodzenia chorego dziecka wynosi jak 1 do 4 (stan homozygotyczności dla genu zmutowanego). W pozostałych przypadkach (3/4) urodzą się dzieci zdrowe (oba geny prawidłowe, stan homozygotyczności dla genu prawidłowego), względnie jeden gen zmutowany i jeden prawidłowy (stan heterozygotyczności, nosicielstwo, tak jak u rodziców). Z punktu widzenia praktycznego, można pominąć udowodnione, choć rzadkie (2 : 1000) przypadki choroby, kiedy to oba nieprawidłowe geny u chorego dziecka pochodzą od jednego z rodziców.

Przypomnieć trzeba, że raz określone ryzyko genetyczne dla danej pary małżeńskiej jest stałe, dotyczy każdej ciąży i nie zmienia się w zależności od liczby posiadanych już dzieci chorych lub zdrowych. W związku z powyższym, każdej rodzinie w której urodzi się dziecko z mukowiscydozą należy zapewnić możliwość uzyskania pełnej porady genetycznej. Jej treść przekazana w odpowiedniej formie i czasie może w sposób istotny wpłynąć na podejmowane decyzje dotyczące planowania kolejnych ciąż, co stanowi ważny element w profilaktyce choroby.

3. PODŁOŻE MOLEKULARNE

3.1. Struktura genu

Gen CFTR (ang. cystic fibrosis transmembrane regulator) został sklonowany w 1989 roku. Stało się to w niespełna cztery lata od chwili określenia jego lokalizacji w długim ramieniu chromosomu 7 (prążek q31.3). Pozycja mapowa została ustalona dzięki wykazaniu sprzężenia genu CFTR ze znanymi markerami chromosomalnymi. Gen CFTR zajmuje obszar około 250 kb i składa się z 27 eksonów. Jest jednym z większych znanych genów człowieka. Wielkość eksonów jest zróżnicowana: od 38 nukleotydów (ekson 14b) do 724 nukleotydów (ekson 13). Wielkości intronów wahają się od 1,1 kb do 40 kb.

3.2. Funkcja białka

Sekwencja aminokwasów białka kodowanego przez gen CFTR została określona na podstawie analizy sekwencji nukleotydów. Kodowany w tym genie polipeptyd, o masie cząsteczkowej około 170 kD, złożony jest z 1480 aminokwasów. Wyróżnia się w nim szereg domen. Pozycję centralną białka zajmuje domena R (regulacyjna). Po obu jej stronach znajdują się domeny określane jako: domena wewnątrzbłonowa i domena wiążąca nukleotydy (ang. nucleotide binding folds, NBF).

Białko CFTR ze względu na swoja strukturę i funkcje zostało zaklasyfikowane do dużej grupy białek transportowych tzw. "ABC family" (ang. ATP-binding cassette) występujących zarówno u bakterii, drożdży, muszki owocowej oraz u ssaków Jest ono błonową glikoproteiną i. U człowieka pełni funkcje kanału chlorkowego w komórkach nabłonkowych. Przypisuje mu się również rolę w transporcie białek przez błonę komórkową. Uszkodzenie tych funkcji, w wyniku mutacji, prowadzi do zmiany kwasowości w organellach komórkowych, powstawania lepkiego (zahamowanie przepływu, wraz z jonami Cl-, wody) o odmiennym składzie białek śluzu i jest prawdopodobnie odpowiedzialne za plejotropowość objawów klinicznych.

3.3. Mutacje

Większość z opisanych w genie CFTR mutacji to mutacje punktowe. W ich wyniku następuje zmiana sensu (ang. missense) zapisu informacji genetycznej lub tzw. mutacje nonsens, odpowiedzialne za przerwanie biosyntezy polipeptydu.

Mutacje missens stanowią około 45% wszystkich znanych mutacji, mutacje nonsens około 18%. Opisano również mutacje o charakterze małych wstawek/delecji (około 23% wszystkich znanych mutacji). Oprócz mutacji eksonowych znanych jest również szereg mutacji na złączach intron/ekson/intron oraz mutacji wewnątrz intronowych odpowiedzialnych za błędną obróbkę transkryptu. Stanowią one około 14% wszystkich typów mutacji. W genie CFTR wielkie delecje występują rzadko. Największa znana delecja, około 40 tysięcy nukleotydów obejmuje eksony od 11 do 18.

Rozkład mutacji jest nierównomierny. Większość z nich koncentruje się w eksonach kodujących domeny wiążące nukleotydy i w domenie regulacyjnej. Oprócz mutacji opisano szereg tak zwanych wariantów polimorficznych. W ten sposób są określane zmiany w sekwencji nukleotydów, których wystąpienie nie pociąga za sobą zmian w sekwencji aminokwasów. Różne typy zmian polimorficznych są wykrywane również w sekwencjach genu nie kodujących informacji o białku, na przykład w intronach.

3.4. Mutacja ∆F508

Najczęściej występującą mutacją, w genie CFTR, jest trójnukleotydowa delecja w eksonie 10. Mutacja ta jest odpowiedzialna średnio za około 70% wszystkich mutacji tego genu. W wyniku mutacji ∆F508 z sekwencji nukleotydów zostaje usunięty, mieszczący się w ramce odczytu, kodon CTT co w konsekwencji powoduje, że fenyloalanina (pozycja 508) "wypada" z łańcucha polipeptydowego. Powstający produkt białkowy jest krótszy tylko o jeden aminokwas, ale polipeptyd nie posiada już zdolności do osiągania w komórce odpowiedniej dla niego lokalizacji.

3.5. Mutacje specyficzne dla określonej populacji

Większość z kilkuset mutacji opisanych dla genu CFTR to mutacje występujące sporadycznie. Pewnym wyjątkiem, poza mutacją ∆F08, są mutacje charakterystyczne dla grupy etnicznej czy populacji. Częstość występowania takich mutacji jest niekiedy wielokrotnie wyższa niż wynikałoby to z uśrednionych danych dla populacji kaukaskiej. "Swoiste" mutacje, których częstość występowania przekracza 5%, stwierdzono w populacjach skandynawskich oraz wśród Żydów Aszkenazyjskich w Izraelu.

3.6. Heterogenność mutacji w genie CFTR

Do końca 1999 roku w genie CFTR opisano około 800 różnych mutacji odpowiedzialnych za modyfikację lub brak jego funkcji. Trudno obecnie wyjaśnić przyczynę tak wielkiej różnorodności mutacji w tym genie. Nawet w populacjach określanych jako wysoce homogenne heterogenność mutacji jest znaczna. Do wyjątków należy kanadyjska populacja Hutteire, w której badając częstość występowania dwóch mutacji (∆F08 i M1101K) identyfikuje się wszystkie zmutowane geny CFTR.

4. NIETYPOWE FORMY MUKOWISCYDOZY

Wykazano, że mutacje genu CFTR stwierdza się także w niezależnie dotychczas klasyfikowanych chorobach takich jak obu- i jednostronna niedrożność przewodów nasiennych, przewlekłe zapalenie oskrzeli, rozstrzenie oskrzeli, przewlekłe zapalenie zatok obocznych nosa z polipowatością, aspergillusowe alergiczne odoskrzelowe zapalnie płuc. Wydaje się, że w tych przypadkach wielość objawów choroby jest przejawem zmienności na poziomie genu, a wymienione schorzenia należałoby klasyfikować jako łagodne postaci mukowiscydozy.

5. DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA

5.1. Typ badania

W analizie DNA, na potrzeby diagnostyki chorób dziedzicznych, obserwuje się zasadniczo dwa typy analizy molekularnej. Pierwszym jest identyfikacja mutacji, drugim badanie markerów polimorficznych.

Identyfikacja mutacji w obu allelach genu CFTR chorego stanowi molekularne potwierdzenie rozpoznania klinicznego. W przypadku analizy markerów polimorficznych badaniu, obok chorego, muszą być poddani jego rodzice. Opiera się bowiem ono na śledzeniu sposobu dziedziczenia się danego genu w rodzinie ryzyka genetycznego. Analiza markerów polimorficznych jest badaniem pośrednim. Opiera się na rozpoznaniu klinicznym ustalonym u probanda i nie może stanowić o weryfikacji rozpoznania.

5.1.1. Identyfikacja mutacji

Podstawą większości metod identyfikacji mutacji w genie CFTR jest analiza powielanego, w reakcji PCR (ang. polymerase chain reaction), odpowiedniego fragmentu genu. Delecje czy też wstawki można wykrywać różnicując elektroforetyczne wielkość wykrywanych produktów. Pomocna w identyfikowaniu wielu mutacji jest analiza restrykcyjna. W taki sposób mogą być wykrywane mutacje, których powstanie wiąże się z utworzeniem lub zanikiem sekwencji nukleotydów rozpoznawanej przez dany enzym restrykcyjny. Wykrywanie szeregu mutacji wymaga jednak w dalszym ciągu stosowania bardziej złożonych technik molekularnych. Identyfikacja mutacji w badaniach rutynowych opiera się o handlowo dostępne testy diagnostyczne. Umożliwiają one identyfikację 8 - 12 najczęściej występujących mutacji w genie CFTR.

Tabela 1

Mutacje najczęściej odpowiedzialne za defekt genu CFTR

* dane Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium
Zacieniowano mutacje najczęściej występujące w populacji polskiej

Przeprowadzone do tej pory, w Zakładzie Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka, badania dla ponad 780 chorych na mukowiscydozę wskazują, że obecnie możliwa jest identyfikacja ponad 70% wszystkich mutacji w tym genie (Tabela 1).

5.1.2. Analiza markerów polimorficznych

Pod pojęciem markera polimorficznego rozumiemy możliwą do wykrycia sekwencję nukleotydów w DNA występującą minimum w dwóch postaciach allelicznych. Ze względu na położenie markery polimorficzne dzieli się na zewnątrz- i wewnątrzgenowe. Identyfikacja markera polimorficznego możliwa jest zarówno techniką hybrydyzacji jak i techniką powielania (PCR). Bardzo przydatna diagnostyczne jest tak zwana analiza haplotypów. Haplotyp określa układ alleli kilku różnych markerów polimorficznych. Analiza haplotypu znacznie uprawdopodobnia wynik badania diagnostycznego.

Gdy wybraną metodą diagnostyczną jest badanie polimorfizmu markerów, analizie DNA muszą być poddani, oprócz chorego, także jego rodzice. Tylko wynik, który umożliwia prześledzenie sposobu dziedziczenia zmutowanych alleli danego genu od obojga rodziców jest diagnostyczne informacyjny. Analiza markerów polimorficznych obciążona jest ryzykiem związanym z możliwością wystąpienia rekombinacji pomiędzy miejscem mutacji a locus wykrywanego markera polimorficznego. Ryzyko to dla markerów polimorficznych stosowanych w diagnostyce mukowiscydozy jest niewielkie (0,004).

Dla populacji polskich rodzin ryzyka mukowiscydozy określono informacyjność 11 zewnątrzgenowych markerów polimorficznych. Najczęściej wyniki informacyjne otrzymano dla markerów KM19/PstI, XV2c/TaqI i D9/MspI (Tabela 2). Analiza haplotypów markerów XV2c i KM19 wykazała, że tak zwany haplotyp B (allel 1 XV2c i allel 2 KM19) w populacji polskiej w ponad 70% występuje wraz ze zmutowanym genem CFTR. Jest to haplotyp największego ryzyka występowania mutacji w tym genie. W populacji polskiej haplotyp B sprzężony jest z mutacją ∆F508 w 98% a w ponad 40% towarzyszy również innym mutacjom.

6. POSTĘPOWANIE DIAGNOSTYCZNE

6.1. Weryfikacja rozpoznania klinicznego

Tak jak dla szeregu innych chorób dziedzicznych pełna weryfikacja rozpoznania klinicznego mukowiscydozy możliwa jest tylko na poziomie molekularnym. W mukowiscydozie taką weryfikację zapewnia identyfikacja mutacji w obu allelach genu CFTR. W populacji polskiej weryfikacja rozpoznania możliwa jest dla około połowy diagnozowanych przypadków. Wynika to ze stosunkowo niskiej, niespełna 70%, częstości wykrywania mutacji w genie CFTR.

6.2. Określanie nosicielstwa mutacji w rodzinie ryzyka genetycznego

Badania nosicielstwa zmutowanego genu CFTR możliwe jest poprzez identyfikację mutacji lub analizę sposobu dziedziczenia genu. Badanie oferowane jest wszystkim członkom rodziny probanda dla którego określono pełny genotyp tj. zidentyfikowano mutacje w obu allelach genu CFTR, względnie otrzymano wynik informacyjny w badaniu markerów polimorficznych.

Tabela 2

Informacyjność badanych markerów polimorficznych