BOTANIKA
Techniki badawcze, mikroskopy
Badania przeżyciowe – materiał Świerzy
-odczynniki nie niszczące żywej, badanej komórki, struktury (potrzebne są takie barwniki, które nie zabijają materiału)
Odpowiednie utrwalenie materiału; zmiękczanie twardych materiałów; odwadnianie i przygotowanie tkanek do barwienia (zależnie od stosowanych barwników)
-utrwalacz chroni przed zniszczeniem badanego materiału
-możemy barwić materiał jednym lub kilkoma barwnikami
Preparaty trwałe: skrawki cięte ręcznie; skrawki mikrotomowe (? tak zapisałam ale słowo do mnie nie trafia !); metoda parafinowa; barwienie; medium zamykające
Przykłady medium zamykającego o konsystencji syropu: DPX, euparal
Specjalne przygotowanie materiału, zależnie od techniki obserwacji / badania (rodzaju mikroskopu)
Rodzaje mikroskopów:
-świetlne (jeden z rodzajów mikroskopów optycznych): Mikroskop optyczny to urządzenie do silnego powiększania obrazu, wykorzystujące do generowania tego obrazu światło przechodzące przez specjalny układ optyczny składający się zazwyczaj z zestawu kilku-kilkunastu soczewek optycznych. Mikroskop optyczny może wykorzystywać zwykłe światło dzienne, dostarczane do układu optycznego przez specjalne lusterko lub wykorzystywać sztuczne światło, którego źródło znajduje się zazwyczaj pod analizowaną próbką. Mikroskopy ze sztucznym źródłem światła bywają nazywane mikroskopami świetlnymi, większość profesjonalnych mikroskopów optycznych posiada jednak współcześnie możliwość pracy z użyciem światła naturalnego i sztucznego. Światło może padać na oglądany obiekt z góry - mówi się wtedy o odbiciowym mikroskopie optycznym. Światło może też padać na badany obiekt z dołu i przechodzić przez niego, co wymaga jednak aby obiekt był półprzezroczysty. Mikroskopy optyczne są stosowane do obserwacji małych obiektów w wielu naukach. W biologii są stosowane np.: do obserwacji drobnoustrojów i budowy tkanek. W chemii i fizyce są stosowane do obserwacji np.: przemian krystalicznych. W geologii są stosowane do obserwacji budowy skał. Mikroskopy optyczne mogą korzystać, ze zwykłego, niespolaryzowanego światła, lub korzystać ze światła spolaryzowanego. W tym drugim przypadku mówi się o polaryzacyjnym mikroskopie optycznym. Posługiwanie się światłem spolaryzowanym umożliwia obserwację wzrostu i zanikania kryształów i ciekłych kryształów. Niektóre mikroskopy optyczne korzystają też ze światła monochromatycznego. Są one często stosowane do obserwacji obiektów w zakresie poza-widzialnym (np.: w podczerwieni lub ultrafiolecie). W tradycyjnych mikroskopach optycznych obserwuje się obiekty przez specjalny okular, do którego przykłada się bezpośrednio oko. W wielu współczesnych mikroskopach optycznych stosuje się obserwację obrazów za pomocą specjalnych kamer i monitorów. Można też podłączać je za pomocą kamer i aparatów cyfrowych do komputerów. Fizyczną granicą maksymalnego powiększenia obrazu w mikroskopie optycznym jest precyzja wykonania soczewek. Najlepsze mikroskopy optyczne, działające na spolaryzowane światło ultrafioletowe osiągają maksymalne powiększenie do ok. 3500x. Mikroskopy działające na zwykłe światło osiągają maksymalne powiększenia rzędu 1500x.
1. Okular osadzony w tubusie; 2. Rewolwer; 3. Obiektyw; 4. Śruba makrometryczna; 5. Śruba mikrometryczna; 6. Stolik; 7. Źródło światła (w prostszych modelach zwierciadło oświetlające); 8. Kondensor; 9. Statyw [ma część mechaniczną i optyczną]
-mikroskop fluorescencyjny - to mikroskop świetlny używany w badaniach substancji organicznych i nieorganicznych, którego działanie oparte jest na zjawisku fluorescencji i fosforescencji, zamiast, lub razem ze zjawiskami odbicia i absorpcji światła (co jest wykorzystane w klasycznym mikroskopie optycznym). Fluoroscencja próbki może być pochodzenia naturalnego (np. fluoroscencja chlorofilu) lub być wynikiem dołączenia (kowalencyjnie lub poprzez jakikolwiek inny typ oddziaływań fizyko-chemicznych między substancjami) do elementów obserwowanej próbki fluoroforów, czyli substancji chemicznych, które fluoryzują po wzbudzeniu światłem o określonej długości. Drugi sposób jest najczęściej wykorzystywanym w biologii, a w szczególności w biologii molekularnej, gdyż pozwala, poprzez znajomość oddziaływań, na wyznakowanie interesujących elementów komórki (np. białek, czy organelli), fluoroforami o zadanych właściwościach (np. barwie emisji). Większość używanych mikroskopów fluorescencyjnych to mikroskopy epi-fluorescencyjne. Oznacza to, że wzbudzenie próbki falą świetlną, jak i jej obserwacja zachodzi znad niej (epi).
Mikroskopy fluorescencyjne stały się ważnym narzędziem w biologii, stając się podstawą do rozwoju bardziej zaawansowanych technik mikroskopii fluorescencyjnej, takich jak:
-mikroskopia konfokalna
-mikroskopia dwufotonowa
-FLIC
-TIRFM
(1)(2)
Przykłady obrazów z mikroskopu fluorescencyjnego
(1): Błona komórkowa drożdży zwizualizowana w mikroskopii fluorescencyjnej.
(2) Interfazowe jądro komórkowe limfocytu poddane badaniu FISH.
-mikroskop stereoskopowy (binokular) - mikroskop optyczny z oddzielnymi okularami dla obu oczu pozwalający na przestrzenne widzenie obrazu powiększanego. Widziany w nim obraz jest trójwymiarowy, dzięki czemu świetnie nadaje się do obserwowania poruszających się np. małych owadów.
[obecna lupa dająca większe powiększenie; możemy zobaczyć obiekty w całości bez krojenia]
-mikroskop polaryzacyjny - mikroskop optyczny używany do badań obiektów anizotropowych w świetle spolaryzowanym. Działanie mikroskopu polaryzacyjnego jest oparte na zjawisku dwójłomności substancji, w których występuje dalekozasięgowe uporządkowanie cząsteczek. Mikroskop ten posiada między okularem i źródłem światła dwa filtry polaryzacyjne. Jeden z nich jest nazywany polaryzatorem i znajduje się między źródłem światła i analizowaną próbką, a drugi jest nazywany analizatorem i znajduje się między próbką a tubusem. Polaryzator i analizator przepuszczają tylko tę część światła, która ma ściśle określoną polaryzację. W trakcie obserwacji są one skręcone względem siebie o 90° (są skrzyżowane), co powoduje, że jeśli próbka nie skręca płaszczyzny polaryzacji światła, to nie może ono przejść przez cały układ. Jeśli próbka jest aktywna optycznie, to wówczas przynajmniej część światła przechodzi przez analizator i dociera do oka obserwatora. Płaszczyznę polaryzacji analizatora można zmieniać uzyskując wygaszanie jednych obszarów i rozjaśnienie innych. Towarzyszą temu zazwyczaj efekty barwne, ze względu na różnice w skręcalności właściwej substancji aktywnej optycznie, dla różnych długości światła. Możliwość regulacji analizatora umożliwia to uzyskanie ostrego i skontrastowanego obrazu badanej próbki. Mikroskop polaryzacyjny stosowany jest m.in. do badania: kruszców, minerałów, preparatów biologicznych, struktury komórek i tkanek, w metalografii, w przemyśle szklarskim i włókienniczym. Zastosowanie znalazł również w badaniu ciekłych kryształów chiralnych. Umożliwia on obserwowanie zmian fazowych, wyznaczanie temperatur przejść fazowych i pozwala na precyzyjne określanie obszarów występowania danej fazy ciekłego kryształu. [w świetle spolaryzowanym kierunek drgań cząsteczek fal świetlnych ograniczony jest do jednej płaszczyzny]
Obraz fragmentu skalenia sodowo-potasowego o rozmiarach 0,4 mm uzyskany w mikroskopie polaryzacyjnym
Filtry polaryzacyjne tj.: polaryzator i analizator; obserwacje struktur analizowanych (zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego)
-polaryzator – pod kondensorem
-analizator – między obiektywem a okularem
Określenie kąta ułożenia mikrofibryli celulozowych w ścianie komórkowej. Budowa ziaren skrobi, kryształów występujących w wakuoli.
-mikroskop kontrastowo-fazowy: mikroskop kontrastujący fazy, rodzaj mikroskopu świetlnego, w którym wykorzystane jest zjawisko interferencji fal świetlnych i przesunięcia fazy światła przy przejściu przez obserwowany preparat; umożliwia obserwację żywych, nieutrwalonych preparatów biologicznych.
Wykorzystuje różnice przechodzenia światła przez obszary komórki o różnym współczynnik załamania; zamiana obiektów fazowych w obiekty amplitudowe.
+kontrast ujemny – na ciemnym tle jasny obiekt
+kontrast dodatni – na jasnym tle ciemny obiekt
Mikroskop fluorescencyjny – fluorescencja to zdolność do emitowania światła o określonej długości fali pod wpływem absorpcji promieniowania pochodzącego z obcego źródła światła
-filtr wzbudzający – od źródła światła do obiektywu
-filtr barierowy – od obiektywu do źródła światła
Fluorochromy – substancje wykazujące zjawisko fluorescencji np. oranż akrydyny (DNA, kutyna, lignina), błękit aniliny (kaloza), kalkofluor (celuloza)
Autofluorescencja – oświetlenie obiektu światłem o określonej długości fali powoduje emisję światła widzialnego np. lignina, chlorofil
Rodamina-falloidyna: falloidyna stabilizuje mikrofilamenty aktynowe, rodamina raje czerwoną fluorescencję
Immunolokalizacja – specyficzność znakowania struktur / związków dzięki reakcji antygen – przeciwciało (np. białka ściany komórkowej, elementy cytoszkieletu, itp.). Przeciwciała łączą się z fluorochromami
Barwniki fluorescencyjne: Barwniki fluorescencyjne absorbują światło o pewnej długości fali, a emitują światło o innej, dłuższej fali. Niektóre z nich wiążą się specyficznie z poszczególnymi cząsteczkami w komórkach, co pozwala badać ich umiejscowienie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Przykładem jest pokazane tu specyficzne wyznakowanie DNA (kolor zielony). Inne znaczniki mogą być sprzężone z cząsteczkami przeciwciał i tworzyć wtedy bardzo świetliste i wszechstronne barwniki, które wiążą się wybiórczo z poszczególnymi rodzajami makrocząsteczek i dają obraz ich rozmieszczenia w komórce. W pokazanym przykładzie białka mikrotubul wrzeciona mitotycznego wybarwiono na kolor czerwony przeciwciałem fluorescencyjnym.
Immunolokalizacja (zapisałam, ale nie znalazłam nigdzie co to jest! :( )
-mikroskop konfokalny - odmiana mikroskopii świetlnej charakteryzująca się powiększonym kontrastem, a zatem i rozdzielczością. Używana do uzyskania wysokiej jakości obrazów oraz rekonstrukcji obrazów w trzech wymiarach. Koncept mikroskopii konfokalnej w porównaniu z klasyczną świetlną-szerokiego pola, opiera się na usunięciu, przy wejściu do detektora, światła, które wpadło do obiektywu spoza płaszczyzny ogniskowania. Usuwa się także wszelkie odbłyski nie pochodzące bezpośrednio z miejsca ogniskowania. Używa się w tym celu dodatkowej przesłony z dziurką, umieszczonej przed wejściem do detektora. Technika mikroskopii konfokalnej znalazła szerokie zastosowanie w naukach biologicznych oraz w technice (na przykład do badania półprzewodników).
Podstawy obrazowania konfokalnego zostały opatentowane przez Marvina Minsky'ego w 1961. W zwykłej mikroskopii (szerokiego pola, w tym mikroskopie fluorescencyjnym) próbka jest oświetlana przez źródło światła w całości. W odpowiedzi na to, albo odbija światło, albo fluoryzuje, przy czym sygnały te są zbierane przez obiektyw. Obiektyw zbiera sygnał nie tylko z miejsca ogniskowania, ale z całego przekroju próbki. Powoduje to, że tło wobec sygnału z miejsca ogniskowania jest dość wysokie, co zmniejsza kontrast. Zastosowanie przesłony z małym otworem przed detektorem (na przykład kamerą CCD), odcina sygnał dochodzący spoza płaszczyzny ogniskowania, co znacznie powiększa kontrast i jakość uzyskanego obrazu. Grubość takiej płaszczyzny ogniskowania, a zatem rozdzielczość pionowa mikroskopu, jest zwykle zależna od soczewek obiektywu, ale też od właściwości samej próbki.
Obecnie używa się głównie trzech typów mikroskopów konfokalnych:
· skanujące laserowe mikroskopy konfokalne (ang. Scanning Laser Confocal Microscopes)
· mikroskopy konfokalne z wirującym dyskiem (ang. Spinning-disk Confocal Microscopes)
· PAM (ang. Programmable Array Microscopes).
Pierwsze gwarantują obrazy najlepszej jakości, ale charakteryzują się długim czasem obrazowania FPS niższa niż 3/sek.. Mikroskopy konfokalne z wirującym dyskiem pozwalają z kolei na bardzo szybkie zbieranie obrazów, co pozwala na montowanie z nich sekwencji filmowych, ale obrazy cechuje nieco gorsza jakość i inne ograniczenia.
[wykorzystuje zjawisk...
julita29