14 Badanie niestabilności genetycznej.doc

BADANIE NIESTABILNOŚCI GENETYCZNEJ I NARAŻENIA NA ZWIĄZKI MUTAGENNE

Niestabilność chromosomowa- zwiększona częstość złamań i innych uszkodzeń (aberracji strukturalnych i liczbowych) chromosomów w komórkach somatycznych badanej grupy w porównaniu do grupy kontrolnej

v     jedna z cech charakterystycznych komórek nowotworowych

v     Xeroderma pigmentosum, ataxia telangiectasia, Anemia Fanconiego

v     niedobory syntezy naprawczej DNA

v     korelacja pomiędzy wysoką spontaniczną łamliwością chromosomów a częstością występowania nowotworów

Testy pozwalające na wykrycie jawnych aberracji chromosomowych:

v     test aberracji chromosomowych (CA)

v     test wymian siostrzanych chromatyd (SCE)

v     test mikrojądrowy (MN)

„Ukryta” niestabilność chromosomowa – w komórkach prawidłowych u osób z nowotworami- widoczna po dodaniu związku indukującego uszkodzenia

v     wyraża się zwiększoną podatnością chromosomów na działanie związków klastogennych o bezpośrednim działaniu, które nie wymagają aktywacji metabolicznej

v     związki klastogenne - indukują aberracje strukturalne chromosomów

v     są to: bleomycyna (BL), diepoksybutan (DEB)

v     wykorzystwana jako marker do oceny sprawności mechanizmów reparacyjnych, biorących udział w usuwaniu zaburzeń struktury chromosomów

v     jest cechą konstytutywną, modyfikującą indywidualną wrażliwość na działanie czynników rakotwórczych.

Testy pozwalające na wykrycie jawnych aberracji chromosomowych:

v     test bleomycynowy

v     test diepoksybutanowy

Test bleomycynowy – ocena niestabilności chromosomowej

v     BL powoduje pęknięcia DNA( złamania chromosomów w fazie S-G2 cyklu komórkowego)

v     hodowla 72h, w 68h dodać 30miliu/ml BL

v     ukrytą niestabilność chromosomową w tym teście ocenia się na podstawie

·         średniej liczby złamań chromatyd w przeliczeniu na jedną komórkę            (tzw. wskaźnik b/c; ang. breaks per cell)

·         procentu metafaz z jednym bądź większą liczbą złamań chromosomów (am%; ang. percentage of aberrant metaphases)

v     wskaźnik b/c:

·         <0,8 – stabilność chromosomowa;

·         0,8-1,0 – niestabilność chromosomowa;

·         ≥1,0 – podwyższona niestabilność chromosomowa

v     bardziej restrykcyjne, podwójne kryterium, uwzględniają oba oceniane parametry (b/c>1 i am%>45)

v     wrażliwość na BL jest cechą konstytutywną komórek i nie podlega wpływom czynników egzogennych

v     nie można jednak stosować dla prognozowania zwiększonej indywidualnej, osobniczej podatności na wystąpienie choroby nowotworowej

v     można jedynie stosować dla charakterystyki genetycznej grup pacjentów, gdyż zwiększona niestabilność chromosomów jest obserwowana u około 16% populacji ludzi zdrowych

Test diepoksybutanowy

v     DEB indukuje efektywnie dwa niezależne zjawiska: aberracje chromosomowe i wymiany siostrzanych chromatyd.

v     hodowla 72 h, w 24 h dodać 0.1 mg/ml DEB

v     wykorzystuje się w diagnostyce anemii Fanconiego (FA)

v     diagnostyka polega na obserwacji w preparatach barwionych barwnikiem Giemsy

v     procentu uszkodzonych komórek (%am),

v     liczby złamań na komórkę (b/c)

v     procentu figur radialnych

v     U chorych z FA obserwuje się

v     %am > 80%

v     b/c> 5.6

v     figury radialne stanowią 30-100% obserwowanych aberracji

Anemia Fanconiego

v     niedokrwistość hipoplastyczna postępująca miedzy 5 a 10 r.ż.

v     wady wrodzone (szczególnie nieprawidłowości kości promieniowych)

v     niski wzrost

v     nadwrażliwość DNA na związki chemiczne tworzące wiązania krzyżowe z DNA – mitomycyna C

v     wzmożona łamliwość chromosomów in vitro pod wpływem DEB

v     zwiększenie ryzyka wystąpienia ostrej białaczki limfoblastycznej (5-10%), raka wątroby i raków płaskonabłonkowych

v     średnia długość życia 16 lat

v     dziedziczenie autosomalne recesywne z genetyczną heterogennością (co najmniej 7 grup genów)

v     Dawka DEB (diepoksybutan)– 0,1 ug/ml

v     Dodany po 24 godzinach hodowli na 48 godzin

hot spots - miejsca w genomie szczególnie wrażliwe na złamania

SCE  =  wymiana chromatyd siostrzanych (ang. sister chromatid exchange)

v     normalny proces podczas mitozy

v     norma  ≤ 10

v     u chorych >100 / metafazę

v     tworzenie czteroramiennych konfiguracji przez pary chromosomów homologicznych, które ulegają somatycznej rekombinacji

Barwienie SCE –różnicowe barwienie siostrzanych chromatyd

v     pozwala na odróżnienie 2 siostrzanych chromatyd chromosomów i określenie częstości wymian miedzy nimi

v     służy do oceny narażenia na czynniki mutagenne oraz łamliwości chromosomów w wrodzonych zespołach niestabilności chromosomów, np. Zespół Bloom’a

Zespół Bloom’a

v     15q26.1 – gen BLM – DNA-zależna ATPaza - replikacja i naprawa

v     mała masa urodzeniowa, niski wzrost

v     wrażliwy na światło rumień twarzy

v     10x wzrost SCE

v     zwiększenie ryzyka wystąpienia nowotworu (ok.. 20%)

v     dziedziczenie autosomalne recesywne

v     Żydzi Aszkenazyjscy

MN - mikrojądra

v     fragmenty chromosomów lub całe chromosomy nieprawidłowo rozdzielone podczas podziału komórkowego.

v     kawałki chromatyny, odłamane, bez centromeru, do którego nie przyczepia się wrzeciono podziałowe

v     dryfuą sobie i po podziale wytwarzją wokół siebie otoczkę

v     są markerem zaburzeń w procesie naprawy uszkodzeń DNA

Test mikrojądrowy (MN)

v     stosowany jest do

o       oceny stopnia uszkodzeń chromosomów na poziomie pojedynczej komórki.

o       wpływu środowiskowych i genetycznych czynników, oraz stylu życia na stabilność genetyczną

v     polega na określeniu częstości występowania w komórce mikrojąder

v     im więcej mikrojader tym więcej uszkodzeń

v     łatwa do zastosowania w ludzkich limfocytach

Mostki nukleoplazmatyczne

v     są obserwowane w niektórych dwujądrowych komórkach a wynikają z ekspozycji na promieniowanie jonizujące lub wolne rodniki.

v     to ciągłe połączenia między jądrami, których szerokość może być zmienna, lecz zwykle nie przewyższa 1/4 średnicy jądra komórkowego.

v     często komórki z mostkami nukleoplazmatycznymi  posiadają więcej niż jedno mikrojądro.

Comet Assay

v     wykrywa złamania pojedynczej i podwójnej nici DNA in situ na poziomie komóki

v     bardzo czuła metoda

v     is relevant for the characterization of apoptotic cells.

v     elektroforeza na szkiełku

v     fluorescencyjne barwniki

v     DNA cale:

v     DNA popękane:

v     im bardziej sie rozlewa tym bardziej popekane jest DNA

...