Natalia Maciejewska, Paulina Rusinek, Aleksandra Smędzik gr. Pon. 12.15
1. Oznaczanie aktywności katalazy (EC 1.11.1.6) i wyznaczanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej.
Cel : Katalaza czyli oksydoreduktaza nadtlenek wodoru : nadtlenek wodoru jest to hemoproteina rozkładająca nadtlenek wodoru wg następującej reakcji :
H2O2 + H2O2 -> 2 H2O + O2↑
Celem ćwiczenia było poznanie szybkości rozkładu nadtlenku wodoru zawartego w roztworze hemolizatu krwinek przez katalazę.
- Wykonano 200-krotne rozcieńczenie hemolizatu krwinek
- Do 6 zlewek o pojemności ok. 25-50 ml odpipetowano po 2 ml 1 M H2SO4 z dodatkiem 1% MnSO4.
- Przygotowano także mieszaninę reakcyjną -> 1,5 ml rozcieńczonego hemolizatu krwinek + 15 ml 0,1 M buforu fosforanowego + 15 ml nadboranu sodu
- Natychmiast do 1 zlewki zawierającej kwas i katalizator odpipetowano 5 ml mieszaniny reakcyjnej. Resztę mieszaniny inkubowano w temperaturze pokojowej i co 3 minuty pobierano próbę i umieszczano ją w kolejnych zlewkach.
- Zawartość zlewek miareczkowano 0,02 M KMnO4
- Otrzymano następujące wyniki:
Tabela 1. Zależność zużytego titranta a ilość rozłożonego nadtlenku wodoru
Numer zlewki
Ilość KMnO4 [ml]
μmol H2O2
1
2,75
137,5
2
1,8
90
3
0,95
47,5
4
0,65
32,5
5
0,4
20
6
0,25
12,5
Wykres 1. Wykres zależności ubytku substratu od czasu.
- Wniosek z ćwiczenia : Im dłużej reakcja enzymatyczna w roztworze nie została zahamowana działaniem kwasu siarkowego, tym więcej cząsteczek substratu zostało rozłożonych na tlen i wodę. Obserwujemy to dzięki spadającej zawartości nadtlenku wodoru w roztworach.
paulinka88x