1.Właściwości enzymów i mechanizm ich działania:
Enzym – chiralny rozpuszczalnik określonego substratu zapewniający środowisko reakcji odpowiednie dla optymalnego efektu katalicznego.-Są to białka o masie z zakresu 9 – 155 kDa jeśli są zbudowane z pojedynczego łańcuca polipeptydowego i do 6x10^6 Da w przypadku enzymów oligomerycznych.-Charakteryzują się strukturalną czułością czyli specyficznością tj. decydują o kierunku przemiany substratów o określonej strukturze. Ich specyficzność jest większa niż innych katalizatorów.-Przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi reakcji o co najmniej 10^6 raza dzięki znacznemu obniżeniu swobodnej energii aktywacji. Jest to efektem niekatalizowanej reakcji.Enzym nie zmienia stałej szybkości reakcji, przyspiesza tylko jej osiągnięcie, obniżenie energii aktywacji zachodzi na skutek zmiany mechanizmów reakcji.
Podany przykład odnosi się do reakcji egzoergicznych. Mogą zachodzić też reakcjie endoergiczne przy udziale enzymów (np. przy ATP, ligazy). Enzymy obniżają energię aktywacji:
2H2O2à2H2O + O2 ; v = k[s] ,,bez katalizatora Ga=75kJ/mol 1,3x10^-11% czast. Reakt.
Katalizator-Pt Ga=50 kJ/mol 3x10^-7% cząst. Reakt.,,2,5x10^4 x przysp. Reak.,,Katalizator katalaza Ga=8,4kJ/mol 4% cząst. Reakt.,,3x10^11 x przysp. Reakcja.
Gdy przyspieszenie reakcji przez enzym jest >10^10-krotne tzn. że enzym doskonale wyewoluował. Jest tak dobrze dopasowany do substratu, że praktycznie już nic nie można zrobić, aby zwiększyć aktywność enzymu.
Wartość współczynnika stałej katalitycznej określa liczbę obrotów danego enzymu. Wynosi od 10 do 10^7 (np. papaina 10, katalaza 10^7, trypsyna 10^3):k(s^-1).Enzymy o małych wartościach „k” katalizują przemiany związków makrocząsteczkowych np. określonych wiązań. ETAPY REAKCJI ENZYMATYCZNEJ:E + S ó ES ó ES0 ó EP ó E + P;1.Rozpoznanie i związanie substratu dzięki oddziaływaniu reszt aminokwasów wiążących zlokalizowanych w kieszeni katalitycznej. Etap fizyczny.2.Etap chemiczny.Konformacyjny stres enzymu indukowany przez zmiany w aktywnym centrum, prowadzący do utworzenia produktu. Enzym wiążący substrat kurczy się – centrum aktywne zamyka się po związaniu substratu. Bardzo wyraźne zmiany konformacyjne.3.Etap fizyczny.Uwolnienie produktu z kompleksu enzym substrat.
2.Ogólny model centrum aktywnego enzymów; rola reszt aminokwasowych.
Centrum aktywne – obszar enzymu o zdefiniowanej objętości i zdefiniowanej strukturze, w którym przyłączany jest substrat i przebiega reakcja przemiany w produkt. W przypadku enzymów globularnych centrum aktywne ma charakter hydrofobowy – aminokwasy polarne znajdują się na zewnątrz, wewnątrz umiejscawiają się aminokwasy z resztami nie polarnymi.
Miejsce wiążące – miejsce w centrum aktywnym, gdzie substrat wiąże się z enzymem. Znajduje się w ok. 20 A od określonych grup atomów lub samych atomów substratu. Oddziaływania pomiędzy substratem a aminokwasami z miejsca wiążącego są szczególnie silne.Aminokwasy kontaktowe wiążące – aminokwasy znajdujące się w obszarze miejsca wiążącego, oddziaływują z atomami lub grupami atomów substratu – niekiedy substrat wiąże się z enzymem kowalencyjnie. Miejsce katalityczne – miejsce w centrum aktywnym gdzie enzym oddziaływuje silnie z substratem. Umiejscowione są w nim aminokwasy kontaktowe katalityczne.Aminokwasy kontaktowe katalityczne (pomocnicze) – niezbędne są do katalizy reakcji choć dla większości nie są poznane funkcje. Można wymienić jedną resztę aminokwasu na inną ale często to upośledza funkcję enzymu. Aminokwasy te wspomagają katalizę choć dokładnie nie wiadomo dlaczego.Aminokwasy stabilizujące - występują poza centrum katalitycznym. Stabilizują one aktywną konformację enzymu. Często w stabilizacji konformacji enzymów biorą udział jony metali.Białka złożone (Haloenzymy) – w centrum katalitycznym znajdują się różne koenzymy, które biorą bezpośrednio udział w reakcji jako ko substraty. RESZTY AMINOKWASÓW WCHODZĄCE NAJCZĘŚCIEJ W SKŁAD CENTRUM AKTYWNEGO.W skład centrum aktywnego wchodzą zazwyczaj aminokwasy polarne ale nie zawsze zjonizowane.His (Histydyna);pK =6-7 pH obojętne jak w komórkach. Może ulegać protonacji i deprotonacji:Dzięki temu, że histydyna może być protonodawcą i protonobiorcą jest składnikiem tzw. Łańcuchów przenoszenia ładunków w komórkach.Ser (Seryna):-w enzymach serynowych – proteinazy lipazy, inne esterazy,-uczestniczy w katalizie z utworzeniem kowalencyjnego intermediatu np. proteinazy serynowe rozcinają wiązania peptydowe i podczas jednego cyklu substrat ulega związaniu wiązaniem kowalencyjnym,-rolę nukleofilu pełni grupa –OH
Asp (Asparaginian),Glu (glutaminian):-np. 2 reszty kwasu asparaginowego wchodzą w skład proteinaz aspartylowych;-Asp, Glu – biorą udział w hydrolizie wielu wiązań glikozydowych.;-W innych hydrolazach często występują reszty Asp, Glu;-Funkcję katalityczną pełni grupa karboksylowa.Cys (Cysteina):-rolę nukleofilu pełni grupa –SH;-Cys działa w parze z His;-Cys występuje w wielu dehydrogenazach sprzeżonych z NAD lub NADP.Arg (arginina):-grupą aktywną jest grupa guanidynowa;-pK = 12,5;-łatwo wiąże grupy ujemne np. reszty ortofosoranowe.Lys (lizyna):-Zawiera dodatkową grupę aminową;-Jest zdolna do tworzenia zasad Shiffa. ;-Może reagować z ketonami np. trans aldolaza.Tyr (tyrozyna):-zawierają aktywną grupę –OH,-są hydroksykwasami ;-w środowisku hydrofobowym działają silniej niż w środowisku hydrofilowym.
5.Kinetyka reakcji enzymatycznych:a) założenia Michaelisa - Menten (M-M): -tworzenie się kompleksu enzym-substrat - E*S:-reakcja jednosubstratowa - E + S ↔ E*S ↔ E*P ↔ E + P analiza przebiegu reakcji w początkowym (vo), bardzo krótkim przedziale czasu; tylko wówczas znamy stężenie substratu ([So]) i można pominąć wpływ bardzo niskiego stężenia produktu a powyższa reakcja upraszcza się do - k1à k2 E + S ↔ E*S → E + P ßk-1;-stężenie molowe substratu wielokrotnie wyższe niż stężenie molowe enzymu, utrzymuje się tzw. stan stacjonarny - stałe stężenie kompleksu E*S przy zmieniających się stężeniach substratu (maleje) i produktu (wzrasta)b)analiza stanu stacjonarnego - stanu zrównoważonych szybkości tworzenia i rozpadu E*S - prowadzi do zależności początkowej szybkości reakcji enzymatycznej (vo) od początkowego stężenia substratu ([So]): Vmax · [So];Km = k-1 + k2 / k+1 - stała M-M, Vmax - szybkość maksymalna ;Km + [So] wykresem tej zależności vo od [So] jest krzywa hiperboliczna ;c) znaczenie poszczególnych parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej: -Km - określa powinowactwo substratu do enzymu; stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji równa się 0.5·Vmax; jednostki stężenia [=] M; najczęstsze wartości w zakresie stężeń mM-mM;-k2 º kkat - stała szybkości reakcji powstawania produktu, tzw. liczba obrotów - ilość moli produktu tworzonych w jednostce czasu (s) przez jeden mol enzymu; jednostki odwrotności czasu [=] s-1, wartości wahają się w granicach od rzędu 106 do mniejszych niż 1 ;-Vmax - maksymalna prędkość katalizowanej reakcji przy danym stężeniu enzymu - aktywność enzymu; jednostki stężenia/czas, najczęściej stosowane mM/s lub mM/s;-kkat /Km - najlepiej określa skuteczność enzymu, jego sprawność przy stężeniach substratu znacznie poniżej wartości Km (odpowiada to często warunkom fizjologicznym); dla najskuteczniejszych enzymów kkat /Km » k1 co oznacza, że wydajność katalizowanych przez nie reakcji jest ograniczona jedynie dyfuzją cząsteczek w roztworze i nie może przekroczyć wartości 108-109 M-1s-1 ;-wyznaczanie wartości Km i Vmax - stosowanie odwróconej postaci zależności M-M; wyrażenie Lineweavera-Burka - 1/vo = 1/Vmax + Km/Vmax · 1/[So] - wykres zależności 1/vo od 1/[So] to linia prosta z charakterystycznymi punktami przecięcia osi 1/[So] = -1/ Km a osi 1/vo = 1/Vmax
7.Enzymy jako bialka globulrne-hierarchiczna struktura bialka globularnego.(wiekszosc enz. Jest bialkami globularnymi) 1.struktura I rzed.- sekwencja AK determnawana genetycznie.2.struktura II rzed-konformacja krotkich fragmentow lancucha(tylko w bialkach fibrylarnych uporzadkowana struktura Iirzed obejmuje >90% lancucha)alfa-helisa i beta faldowa,njczesciej nieco deformowane,stabilizowane przez wiazania wodorowe(w alfa-helisie co 4 reszta AK,w beta-faldowej miedzy rownoleglymi)3.struktura IIIrzed.-ostateczne zwiniecie lancucha w przestrzeni.-strukture naddrugorzedowe-okreslaja charakterystyczna strukture przyleglych do siebei krotkich fragmentow o zdefiniowanej strukturze IIIrzed,moga byc struktury mieszane,-domeny bialkowe-wiekszy fragment czasteczki bialka wyraznei wyodrebniamy samodzielna strukture.-bialko globularne jako calosc czasteczki.4.agregat bialkowy-odpowiednik struktury Ivrzed en.digomeryczne..Wiekszosc en.-delikatne bialka globularne,ktore latwo ulegaja denaturacji.Mozliwa nieskonczona liczba konformacji,ale najczesciej wykorzystuja jedna aktywna konformacje-sfaldowanie korzystnie termodynamicznie zapewniajace czasteczce najwieksza stabilnosc.Reszta aminokwasowa-czasteczka AK,gdzie grupa alfa-aminowa i karboksylowa jest zaangazowana w wiazanie peptydowe,dotyczy AK zlokalizowanych we wnetrzu lancucha,zakonczone z jednej strony AK N-terminalnym,z drugiej C-terminalnym(-NH,-CH,-CO)
Grupa peptydylowa- gr.karboksylowa jednego AK i gr iminowa drugiego(-CH,-CO,-NH).Jednostka sztywna w wiazaniu peptydowym jest polaczenie C=O-NH,najczesciej lezy w 1 plaszczyznie.STRUKTURY IIRZ.Alfa-helisa-rdzen lancucha polipeptydwego oplata hipotetyczny walec 3,6reszt AK/1obrot helisy,trzyma sie dzieki mostkam wodorowym co 4 reszty,miedzy grupa iminowa i korbonylowa.Wiazanie wodorowe neco odchylone od pozycji rownoleglej wzgledem osi drugiej helisy.W bialkach enzymatycznych odcinku helikalne nie sa zbyt dlugie.beta-faldowa-dwa fragmenty lancucha polipeptydowego sa polaczone siecia wiazan wodorowych miedzy grupa iminowa a karboksylowa,ma charakterantyrownolegly:N->c,C<-N.Wiazania prostopadle do osi dlugiej.Stosunkowo krotkie odcinki w bialkach enzymatycznych.2rodzaje:antyrownolegle i rownolegle,znacznei dluzsze petle,wiazania wodorowe lacza te struktowy poprzecznei.STRUKTURA IIIRZ.Dehydrogenaza oldehydu 3-P-glicerynowego sprzezona z NAD(2 domeny:dolna z miejscami wiazania koenzymu([struktury beta i alfa],gorna katalityczna-prewaga beta)Struktora domeny wiazacej koenzym w roznych enzymach jest zblizona-podony uklad odcinkow alfa i beta-swiadczy o wspolnym eolucyjnym pochodzeniu.ODDZIALYWANIA UTRZYMUJACE STRUKTURE WYZSZEGO RZEDU-wodorowe(inne niz te stabilizujace strukt Iirze)1.miedzy grupami-OH Ser,Tyr,Thr.2.miedzy –OH Tyr a –COOH Asp i Glu.3.miedzy zjonizowanymi grupami NH3 i –COO4.miedzy grupa karboksylowa wiazania peptydowego a grupa –OH.—hydrofobowe(gl. Phe-Leu,Phe-Phe)w bialkach globularnych rozpuszczalnych w wodzie reszty AK hydrofobowych sa we wnetrzu czasteczki.—jonowe-miedzy naladowanymi przeciwnie gr.—mostki disiarczkowe.—oddzialywania Van der Walsa
AGREGATY BIALKOWE-STRUKTURA OLIGOMERYCZNA(IVRZ)wszystkie podjednosti wykazuja te sama f-cje katalityczna np.dehydrogenaza mleczanowa-4 jednostki.czasem aktywnosc podjednostek w oligomerze jest inna niz aktywnoasc rozdzielonych,najczesczescij jednostki po rozdzieleniu nei wykazuja zadnej aktywnosci,ale czasem moja inna np.dehydrogenaza glutaminowa(katalizuje oksydatywna deaminacje Glu)-tetramer rozdzielone podjednostki katalizuja oksydacyjna deaminacje Ala.Moga wystepowac podjednostki regulatorowe-reguluja f-je i aktyw. Podjednostek katalitycznych na zasadzie allosteru:jezeli do podjednostki regulatorowej przylaczy sieaktywator(inhibitor) allosferyczny,wzrasta(spada) aktyw. Jednostki katalitycznej.Najczesciej przy parzystej liczbie podjednostek np.ureaza Jaś-6podj.Jezeli jenostki maja te sama f-je=>sblizona masa,jezeli wystepuja jednostki regulatorowe=>inna asa niz katalit
. 8. Enzymatyczne reakcje karboksylacji:Mechanizm działania:-biotyna występuje w białku BCCP, które jest obecne we wszystkich karboksylazach,-podjednostki karboksylujące biotynę katalizują reakcję,-reakcje karboksylacji to reakcje endoergiczne – energia dostarczana jest przez rozkład ATP,-do centrum aktywnego karboksylazy biotyny przyłącza się jon HCO3- i ATP oraz kieruje się tam główka biocetyny. Biocetyna przyłączonym CO2 kieruje się do centrum aktywnego drugiej podjednostki, gdzie przyłączany jest właściwy substrat.Reakcja zapoczątkowująca syntezę kwasów tłuszczowych:-kompleks karboksylazy277 na podjednostki:dimer BCCP,dimer karboksylazy biotyny;-kompleks ten jest regulowany na drodze allosterycznej;-biosynteza kwasów tłuszczowych jest regulowana na poziomie karboksylazy
9.Synteza kwasów tłuszczowych jako przykład kompleksu wieloenzymowego.
Kompleks karboksylazy acetylo-CoA i syntetazy kw.tluszczowych sa niezbedne,aby ta synteza zaszla.Syntetaza kw.tluszczowych-kompleks inny u Eukaryota i Prokaryota.PROKARYOTA:-6 podjednostek katalitycznych,-paleczkowate bialko ACP.1.transacetylaza acylowa-przylacza reszty acetylowe i acelowe,2.transacelaza malonylowa-przylaczareszty malonylowe(karboksylowane reszty acetylowe),3.syntetaza 3-ketoacylowa(enzym kondensujacy)-kondensacja reszty acelowej z malonylowa,a potem rzeszty acylowej z malonylowa,4.reduktaza 3-hydroksyacyloACP,reduktorem jest NADPH-redukuje reszte ketoacelowa do hydroksylowej,5.dehydrotaza 3-hydroksyaceyloACP-przeksztalcareszte hydroksyacylowa do enoilowej,6.reduktaza enoiloACP,7.bialko ACP z fosfopantoteina.Dzieki centralnej grupie –SH(dlugie ramie molekularne)poszczegolne substratysa pszenoszone przez pantoteine i moga byc wprowadzane do centrow aktywnych kolejnych podjednostek,przeniesione reszty lacza sie wiazaniami tioestrowymi.EUKORIOTA:-2 podjednostki,kazda o charakterze wielodomenowym w ednej podjednosce wystepuja wszystkei domeny o odpowiednich aktywnosciach.2 subdomeny polaczone linkarem:w 1-szej:domena kondensujaca,przenoszaca reszty acylowe,przenoszaca reszty malonylowe,hydotaza;w 2-girj:reduktazy,domena odpowiadajaca bialku ACP,tioesteraza(domena odszczepiajaca kw.tluszczowy).Synteza wyzszych kw.tluszczowych odbywa sie w cytoplazmie i w sensie chemicznym stanowi odwrocenie beta-oksydacji(utlenianie,FAD,NAD)-w syntezie:redukcja,NADPH2.(kiedys uwazano ze beta-oksydacje i synteza katalizuja te same enzymy.SUBSTRATY DO BIOSYNTEZY KW.TLUSZCZOWYCH:-rezsty acelowe dostarczane przez CoA pochodza z beta-osydacji kw.tluszczowych lub oksydacyjnej dekarboksylacji pirogranianu-oba te procesy zachodza w mitochondrium=>konieczny transport do cytoplazmy.,sa za malo aktywne na potrzeby reakcji biosyntezy.-reszty malonylowe powstale przez karboksylacje reszt acetylowych,dopiero taka reszta jest wystarczajaco aktywna.
10.Szlak syntezy kwasów tłuszczowych:
1.CoA dostarcza reszte acetylowa,ktora laczy sie z tiolem centrum bialka ACP,dolacza sie CoA 2.bialko ACP przezuca reszte do tiolu peryferyjnego 3.do tiolu centralnego przylacza sie reszta malonylowa,odlacza sie CoA 4.rzeszta malonylowa przenoszona na acetylowa,odlacza sie CO2, kondensacja 2 reszt,powstaje trojweglowa reszta ketoacelowa 5.reduktaza redukuje grupe korbonylowa do hydoksylowej 6.dehydrotacja,powstaje reszta enoilowa 7.redukcja reszty enoilowej(NADPH) 8.4-weglowa reszta acylowa przezucana na acylotransferaze,ktora przenosi ja na tiol pereferyjny enzymukondensujacego=>wolny jest tiol centralny,przelacza sie tam kolejna reszta malonylowa.proces zachodzi az do uzyskania kw.palmitynowego-dalsze wydluzanie w innym kompleksie(desaturazy-wprowadzaja wiazania podwojne odszczepiajac wodor.
11.Klasyfikacja enzymów:a/ oksydoreduktazy - Aoks + Bred Û Ared + Boks - reakcje utleniania-redukcji *dehydrogenazy - AH2 + NAD+ (FAD) Û A + NADH + H+ (FADH2) koenzymy: NAD+, rzadziej NADP+ - pochodne niacyny, witaminy PP (B3),FAD, rzadziej FMN - pochodne ryboflawiny, witaminy B2 (przykłady - dehydrogenaza mleczanowa i bursztynianowa oraz mechanizmy przenoszenia elektronów z udziałem tych koenzymów) DPT (difosfotiamina) - pochodna tiaminy, witaminy B1 , która wraz z liponianem są niezbędnym elementem funkcjonalnym dehydrogenaz ketokwasów (pirogronian, a-ketoglutaran i inne pochodne aminokwasów) *oksydazy - AH2 + O2 Û A + H2O2 ; koenzymy: FAD, FMN (przykłady - oksydaza glukozy, oksydazy L- i D-aminokwasów)*oksygenazy:- dioksygenazy - AH2 + O2 Û A(OH) 2 (niezbyt często występujące);- monooksygenazy - AH + O2 + NADP+ Û A(OH) + H2O + NAPDH,(hydroksylazy); koenzymem obok NADPH + H+ jest hem (cytochrom P450, wiele reakcji przemian steroidów; procesy detoksykacji) a także witamina C (np. reakcja hydroksylacji proliny w trakcie syntezy kolagenu - hydroksylaza proliny)*peroksydazy - AH2 + H2O2 Û A + 2H2O ; koenzym - hem (przykład - peroksydaza glutationowa: 2GSH + H2O2 Û GSSG + 2H2O; enzym z selenocysteiną, uczestniczy w procesach usuwania reaktywnych form tlenu) *katalaza - H2O...
liliw