1. właściwości enzymów i mechanizm ich działania
Podstawowe cechy enzymów
1) Są to białka o masie z zakresu 9 – 155 kDa, jeśli są zbudowane z pojedynczego łańcucha polipeptydowego i do 6 X 106 Da w przypadku enzymów oligomerycznych.
2) Charakteryzują się strukturalną czułością czyli specyficznością tj. decydują o kierunku przemiany substratu(ów) o określonej strukturze lub specyficzności jest wyższa niż innych katalizatorów.
3) Przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi reakcji, dzięki znacznemu obniżeniu energii aktywacji, Jest efektem zmiany molekularnego schematu reakcji.
Enzym obniżający energię aktywacji
2H2O2 → 2H2O + O2 ↑
1) Reakcja nie katalizowana GR=75 kJ/mol 1,3 x 10-11% cząstek aktywnych.
2) Obecność platyny GR=50 kJ/mol ; 3 X 10-7% cząsteczek aktywnych: V wzrasta 2 X 104 raza.
3) Obecność katalazy : GR=8,4 kJ/mol ; 4% cząsteczek aktywnych: V wzrasta 3 x 1011 raz.
Enzymy zmieniają mechanizm reakcji E+S↔ES↔ES*↔EP↔E+P
1) Związanie substratu następuje poprzez oddziaływanie z resztami aminokwasowymi wiążących, zlokalizowanych w kieszeni katalitycznej (etap charakteryzowany przez Km).
2) konformacyjny stres enzymu indukowany przez zmiany w aktywnym centrum, prowadzący do utworzenia produktu (etap entropowy charakteryzowany przez wartość stałej katalitycznej kkat)
3)utworzenie produktu z kompleksu z enzymem
2. ogólny model centrum aktywnego enzymów; rola reszt aminokwasowych budujących centrum
Kieszeń katalityczna
Zwana również centrum aktywnym lub szczeliną, tunelem lub kieszenią katalityczną.
Znajduje się w obszarze hydrofobowym białka globularnego. Stąd silniejsze oddziaływania aminokwasów położonych. Wyróżniamy w centrum aktywnym: aminokwasy kontaktowe występują w obszarze katalitycznym centrum aktywnego oraz w miejscu wiązania substratu.
Pewne aminokwasy kontaktowe są bardzo blisko substratu. Jedna z ich klas to aminokwasy wiążące substrat; siły wiążące substrat to:
- oddziaływania wodorowe
- oddziaływania Van der Valsa
- oddziaływania hydrofobowe
Aminokwasy w centrum aktywnym oddziaływają z grupami funkcyjnymi substratu. Są to właściwe katalizatory S→P.
Aminokwasy pomocnicze również znajdują się w centrum aktywnym ale nie oddziaływają z substratem. Są niezbędne w katalizie. Ich wymiana na drodze mutacji prowadzi do upośledzenia formy enzymu.
Występują również aminokwasy stabilizujące aktywną konformację enzymu zkompleksowane z jakimś metalem (głównie z jonami Ca). Znajdują się one poza centrum aktywnym. Z Ca związana jest np. α-amylaza słodowa, subtylizyna, trypsyna.
Istotą działania enzymu jest zmiana mechanizmu reakcji i przyspieszenia tempa reakcji
Stała efektywności
katalitycznych
powinowactwo
E do S (I etap)
Przemiana S→P
określa II etap
3. znaczenie warstwy wody niezbędnej enzymów w biokatalizie niewodnej
Enzymy nie wykazują aktywności w środowisku całkowicie pozbawionym H2O. Obecność cząsteczek H2O jest bardzo ważna dla stabilizacji 30 struktury oraz aktywności H2O
O roli H2O w procesie katalizowanym enzymatycznie w środowisku niewodnym decydują właściwości stworzenia przez nią na powierzchni cząsteczki białka enzymatycznego bardzo cienkiej warstewki – woda niezbędna
Woda niezbędna związana z powierzchnią białka enzymatycznego w środowisku polarnym usztywnia jego konformację katalityczną oraz pozwala na przemieszczenie się ładunkom elektrostatycznym między polarnymi grupami aminokwasów. Pełen zasięg jej oddziaływania na enzymy nie jest jednak całkowicie poznany.
4. rodzaje katalizy enzymatycznej
Przyjmuje się, że reakcja enzymatyczna zachodzi według jednego z czterech poniższych mechanizmów lub ich kombinacji.
Przyspieszenie reakcji enzymatycznej dokonują się po przez
1) katalizę przez zbliżenie reagujących grup i cząstek.
2) enzym lub koenzym.
3) kataliza kwasowo-zasadowa
4) kataliza przez odpowiednią deformację cząstki substratu
Efekty katalityczne tych mechanizmów można szacować, korzystając z badań wpływu różnych czynników.
5. kinetyka reakcji enzymatycznych
Na szybkość reakcji wpływa: stężenie reagentów- substraty i kosubstraty, stężenie enzymu, czas reakcji, pH i temp. reakcji, obecność dodatkowych substancji- aktywatorów i inhibitorów. Enzym nie zmienia stałej równowagi reakcji, przyspiesza osiągnięcie stanu równowagi. Wykres V od E (S-const)- linia prosta od 0, wykres V od S(E-const)- hiperbola- 1/2Vmax=Km, równanie Michaelisa-Menten: V=Vmax/(Km/S+1); 1/Km- powinowactwo enzymu do substratu; k kat- stała katalityczna określa liczbę obrotów enzymu; k kat/Km=K eff- stała efektywności, wydajności katalitycznej; wykresy V od t i V od pH- krzywe dzwonowe. Enzymy allosteryczne działają niezgodnie z kinetyką Michaelisa-Menten – wykres V od S- kształt sigmoidalny(jak wzrost biomasy)
6. stałe kinetyczne charakteryzujące przebieg reakcji
Km- jest to pierwsza stała kinetyczna, określa ona pierwszy etap reakcji enzymatycznych.
Km (stała Michaelita) jest stężenie substratu, dla którego szybkość reakcji enzymatycznej osiąga połowę szybkości maksymalnej. Stała michaelita jest to zatem takie stężenie substratu, przy którym połowa cząsteczek enzymu obecnych w układzie jest związana w kompleksy z cząsteczkami substratu, czyli:
Gdy [S]=Km to v=1/2V
Matematyczną zależność miedzy v,[S],Km przedstawia równanie Michaelita- Menten:
Drugą część reakcji enzymatycznej określa tzw. Stała katalityczna Kkat- określa ona osiągnięcie aktywności przez kompleks ES oraz etap w którym substrat w kompleksie z enzymem przekształca się w produkt.
Kkat [s-1]→ mówi ile cząsteczek substratu przekształca się w ciągu 1s w jedną cząsteczkę produktu
Stała katalityczna określa tzw. Liczbę obrotów enzymu.
Keff- stała efektywności katalitycznych
7. enzymy jako białka globularne – hierarchiczna organizacja cząsteczki
Większość poznanych enzymów to białka globularne. Szczególnie dotyczy to białek rozpuszczonych w macierzy mitochondrialnej oraz białek zlokalizowanych w błonach. Wyróżnia się kilka poziomów uporządkowania struktury białka.
Struktura 1-rzędowa:sekwencja aminokwasów w cząsteczce, strukturę determinują wiązania peptydowe. Struktura 2-rzędowa:struktura krótkich fragmentów łańcucha polipeptydowego, struktura głównego łańcucha bez reszt bocznych, stabilizują jąwiązania wodorowe.
Struktura 3-rzędowa:zwinięcie łańcucha w przestrzeni. W obrębie tej struktury wyróżnia się: a)strukturę naddrugorzędową- uporządkowanie przyległych do siebie krótkich fragmentów polipeptydowych;b) domena białkowa-wiekrzy odcinek łańcucha polipeptydowego wyodrębniony w samodzielna strukture przestrzenna(domena strukturalna),może pełnic określone funkcje-domena funkcjonalna;c) białko globularne.
Srtuktura 4-rzędowa: agregat białkowy-struktura zbudowana wielu podjednostek(identycznych bądź różnych).Każda z podjednostek może mieć różną funkcje.
Rodzaje 2-rzędowej struktury:
alfa-helisa:charakter walca, na jeden obrót śruby przypada 3,6 reszt aminokwasowych, stabilizowana przez wiązania wodorowe,powstają co 4 jednostkę peptydowa, przykład to alfa-keratyna;
beta-harmonijka:bardziej rozciągnięta niż alfa-helisa, odległości miedzy resztami są wieksze, stabilizowana przez wiązania wodorowe-powstaja między różnymi pept., przykład beta-keratyna.
Struktury naddrugorzędowe –w wielu bialkach globularnych elementy struktury 2-rzędowej(helisa-alfa,harmonijka-beta) kształtuja motywy naddrugorzędowe.
Typy 3-rzędowej struktury :
α-występuja odcinki o strukturze alfa-helisy,które związane sa ze soba w sposób nieuporządkowany.
β-wystepuja odcinki o strukturze beta harmonijki
α+β-połączenie odcinkówo strukturze alfa-helisy z odcinkami o strukturze b-harmonijki, związane ze soba w sposób nieuporządkowany
α\β ○-domena alfa-helisy, □-domena beta-harmonijki
Motywy naddrugorzędowe:
1)spinka do włosów-struktura przeciwrownoległa
2)crossover-struktura równoległa
3)beta-meander
4)klucz grecki
5)motyw beta-alfa-beta
Wiązania wodorowe struktury 3-rzedowej: miedzy grupami –OH, miedzy grupa –OH i gama lub delta-karboksylowa tsp lub Glu, miedzy grupąamoniową i karboksylanowa, miedzy grupa-OH i grupa peptydowa.Wiązana sa silniejsze gdy atomy ustawione SA w tej samej linii.
Wiązania stabilizujące cała strukture: mostki disiarczkowe,oddziaływania Van der Waalsa, wiazania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne, wiązania hydrofobowe. Reguły rządzące zwinięciem białka globularnego: Białka globularne zwija się tak, ze w jego wnętrzu znajduja się reszty aminokwasow apolarnych ( ewentualnie reszty aminokwasow polarnych ale niejonizujacych). Na powierzchni bialka występują aminokwasy polarne i jonizujące. Powierzchnia jest wiec hydrofilowa, białko otacza warstwa dipolów wody. Warstwa chroni bialko przed denaturacja i agregacją. W przypadku białek błonowych jest odwrotnie-na zewnatrz znajduja się reszty ak. Polarnych. Hydrofobowa powierzchnia jest związana z tym, ze bialka te występują w warstwie lipidowej.
8. enzymatyczne reakcje karboksylacji
Karboksylaza pirogronianowa to enzym współdziałający z biotyna.Biotyna przyłacza się do enzymu poprzez reszte lizyny wystepujaca w centrum aktywnym enzymu.Powstaje wiazanie amidowe pochodzące od grupy karboksylowej biotyny i grupy aminowej reszty lizyny. Tworzy się ramie molekularne.
Reakcja karboksylacji składa się z dwóch części
1)przyłaczanie CO2 do biocetyny.Reakcja wymaga energii,która pochodzi z rozkładu ATP.
2)przemieszczanie CO2 z biocetyny na pirogronian, który znajduje się w centrum aktywnym.
CH3 CO2 ATP ADP+Pi COO-
C=O--------↓-----↓--------------↑-----à CH2
COO- C=O
pirogronian COO- szczawiooctan
9. syntetaza kwasów tłuszczowych jako przykład kompleksu wieloenzymatycznego
Na przykładzie syntetazy z E.coli. Jest to kompleks wieloenzymatyczny.Katalizuje ciąg reakcji znacznie bardziej skomplikowanych niż karboksylaza. Zbudowana jest z 6 podjednostek o różnej aktywności katalitycznej i białka ACP o niskiej masie cząsteczkowej.Białko umieszczone jest centralnie na jego końcu(białko pałeczkowate przenoszące reszty acylowe, pełni funkcje ramienia molekularnego, umozliwia przenoszenie kolejnych grup arylowych do poszczególnych jednostek o roznej aktywności)
Aktywnośc poszczególnych podjednostek:
1)Aktywność acetylotransferazy-do jej centrum aktywnego enzym może przyłączać reszty acylowe,w tym acetylowi.Reszty sa przyłączane do tzw. tiola centralnego i są tiolowane.
2)Aktywność malonylotransferazy- wiąże grupę malonylową
3)Enzym kondensujący-zawiera grupy –SH cysteiny(tiol peryferyjny)
4)Aktywnośc reduktazy 3-ketoacylowej współdziałającej z NADPH2
5)Aktywność dehydratazy 3-hydroksyacylowej-odłacza H2O od 3-hydroksyacylu przenoszonego przez ramie molekularne.
6)Aktywnośc reduktazy oleinowej (2,3-dihydroksyacylowej)-reduktorem jest NADPH2
10. szlak syntezy kwasów tłuszczowych
Biosynteza kw. tłuszczowych odbywa się w cytozolu. Do procesu potrzebny jest acetyloCoA który powstaje w wyniku katabolizmu glukozy przy udziale dehydrogenazy pirogronianowej. * aktywacja acetyloCoA przez karboksylazę do malonyloCoA w obecności ATP i witaminy H (biotyny). Jest to karboksylacja acetyloCoA do malonyloCoA.
*drugi etap to węglowodorowego kw. tłuszcz. z udziałem syntetazy kwasów tłuszczowych.
W I reakcji zostaje przeniesiona reszta acetylowi CoA na grupe tiolową fosfopantoteiny. W II reakcji reszta fosfopantoteiny zostaje przeniesiona na tiol peryferyjny enzymu kondensującego, w czym uczestniczy acetylotransferaza. W kolejnej reakcji zostaje wykorzystana reszta malonylowa, która zostaje przyłączona do tiolu centralnego przy udziale malonylotransferazy. Nastepnie enzym kondensujący katalizuje przeniesienie 2-weglowej reszty acetylowej na 3-weglową reszte malonylową. Powstaje 4-weglowa reszta 3-ketoacytelowa. Tiol peryferyjny jest wolny a tiol centralny wiaże resztę 4-weglową przy jednoczesnej dekarboksylacji. Kolejna reakcja jest katalizowana przez reduktazę 3-ketoacylową. Reduktorem jest NADP. Redukcji ulega tlen przy 3-weglu i powstaje reszta 3-hydroksyacylowa. Nastepnie ma miejsce reakcja dehydratacji i powstaje wiązanie podwojne pomiędzy 2 i 3 węglem i resztą enolową. Kolejna reakcja katalizowana jest przez reduktazę enoilowa przy udziale NADPH2. powstała reszta zostaje przerzucona na tiol centralny przez acylotransferaze. Tiol centralny ulega odblokowaniu, dzieki czemu może przyłączyć się grupa malonylowa i cykl powtarza się.
Synteza sprowadza się do wiazania reszt 2-weglowych .Tiol centralny przenoszący kolejne intermedianty znajduje się na giętkich ramionach dlatego może kierowac włączone grupy do odpowiednich podjednostek
11. klasyfikacja enzymów
1)oksydoreduktory-reakcje,utleniania i redukcji,przenoszenieelektronów
2)transferazy-przenoszenie różnych grup chemicznych, atomów (oprócz wodoru)
3) hydrolazy-rozkład wiązań kowalencyjnych z przyłączeniem cząsteczki wody
4)liazy-rozkład wiązań na drodze nie hydrolitycznej
5)izomerazy-katalizują przekształcenia wewnątrzcząsteczkowe(epimery LwD,izomery cis w trans, przenoszenie grup chemicznych w obrebie tej samej cząsteczki)
6)ligazy-katalizują reakcje syntez wymaga współdziałania związku wysokoenergetycznego
12. metody i warunki oznaczania aktywności ezymów. Jednostki aktywności, aktywność ogólna, aktywność właściwa
(1)spektrofotometryczne-pochłaniają światło (substraty lub produkty)
W zakresie światła widzialnego lub UV Są to najczęściej związki posiadające wiązanie podwójne lub są to związki aromatyczne lub ich pochodne. Kuweta do pomiaru powinna być termostatowana w temperaturze badanego roztworu.
(2)fluorescencyjne-są to metody bardzo czułe. Wyznaczamy aktywność bardzo niewielkiej ilości enzymów. Związki które wykorzystujemy to np. umbelifeol. Metoda ta prowadzona jest w płytkach Elisa, które składają się ze studzienek, a w nich około 50 µl mieszaniny reakcyjnej. Mierzymy na fluoroskanie, absorbancję odpowiednich związków. Metoda ta jednak jest bardzo kosztowna.
(3)met. manometryczna-stosujemy ją tylko wtedy, gdy komponent reakcji jest w stanie gazowym np. oznaczenie aktywności oksydaz (substratem jest O2) oraz dekarboksylazy (produkt CO2). Pomiary przeprowadzamy w aparacie Wartburga, oznaczając ilość uwolnionego gazu.
(4)met potencjometryczna-metoda oparta na pomiarze pH badanego roztworu. Stosuje się tu metodę ciągłego miareczkowania w pH-stacie.
(5)z odbiorem prób (np. kolorymetryczne) jest to chemiczny pomiar ubytku substratu lub przyrostu produktu, np. nieorganiczny fosfor, oznaczając tym samym aktywność fosfataz i fosforylaz.
(6)wiskozymetryczna-oparta na zmianie lepkości podczas reakcji enzymatycznej, spowodowanej rozkładem wielkocząsteczkowych substratów. Np. aktyw.enzymów proteolitycznych-rozkład pektyny. Mierzymy lepkość wyjściowego roztworu, a następnie lepkość po przeprowadzeniu reakcji enzymatycznej. Taki pomiar umożliwia pomiar szybkości początkowej.
(7)polarymetryczne-są stosowane, gdy nieaktywny optycznie substrat przekształca się w aktywny optycznie produkt lub gdy mamy różnicę w skręcalności płaszczyzny światła, np. rozkład sacharozy na fruktozę i glukozę.
Aktywność enzymów podaje się w jednostkach aktywności enzymatycznej [U] – jest to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu w ciągu 1 minuty, w standardowych warunkach reakcji przy stężeniu substratu gwarantującym max szybkość reakcji. Mianem jednostki standardowej jest więc [µmol/min.]. Równie często stosowana jest jednostka zwana katalem. Określa ona tą aktywność (ilość lub wielkość aktywnośći), która przekształca 1 mol substratu w czasie 1 sekundy, czyli katal to [mol/s]. Wartością charakteryzującą preparat enzymatyczny jest aktywność właściwa wyrażana w liczbie jednostek aktywności enzymatycznej na mg białka preparatu [U/mg].
13. metody dezintegracji komórek i tkanek
Zarówno do badania budowy jak i funkcji musimy posiadać homogeny enzym. Metody:
(1)mechaniczne
- ucieranie biomasy, tkanki z materiałem ściernym (piasek chemicznie czysty; szkiełko nakrywkowe utłoczone; wodorotlenek glinu-żel aluminiowy; kuleczki szklane-balkiny-wykonywane ze szkła organicznego o różnych średnicach; w homogenizerach z nożami tnącymi). Podczas izolacji dobrze dodać koktajl inhibitorów proteinaz.
- wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie biomasy (wstępnie utarta lub zdeintegrowana w homogenizerze szybko się zamraża, np z etanolem), ulega zamrożeniu zarówno woda wewn jak i zewn. Kryształy, które powstają powodują uszkodzenie błony kom., następnie powoli rozmraża się taką biomasę i wówczas płyn komórkowy wycieka. Często powtarza się to wielokrotnie.
- dezintegracja przy stosowaniu prasy francuskiej-pod bardzo wysokim ciśnieniem przepuszcza się zamrożoną biomasę przez szczeliny, które są mniejsze niż średnica komórek; ciśnienie powyżej 4000 Atm.(zwykle dla drobnoustrojów).
(2)chemiczne
- działanie lizozymem (bakterie G(+)).
- działanie rozpuszczalnikami organicznymi, np. poluenizacja-rozpuszczenie lipidów i treść komórkowa jest łatwiej dostępna.
Najtrudniej wyizolować enzymy błonowe, gdyż wykorzystują stabilność w kompleksie z błoną, a po oddzieleniu od błony tracą stabilność i ulegają denaturacji. Niektóre można wyizolować stosując detergenty niejonowe. Procedurę izolacji enzymu prowadzimy w temp do 4st.C. najpierw trzeba uzyskać frakcję samych białek przez wysalanie białek lub przez ich wytrącnie rozpuszczalnikami organicznymi (etanol, izopropanol, aceton-silnie schłodzony do ok.
[-20st.C] – [-25st.C]. proces przeprowadza się w kriostacie, prowadzi się go krótko 1-2 godz., aby jak największa część białka uległa denaturacji i należy tak działać, aby wytrącony osad dał się rozpuścić). W przypadku białek wysolonych roztwór trzeba odsączyć przez dializę lub filtrację żelową na sitach molekularnych.
14. rodzaje chromatografii kolumnowej stosowane w preparatyce białek enzymatycznych
Metody chromatograficzne:
(1)sączenie molekularne na sitach molekularnych. Stosuje się tu Sephandex (jest dekstranem podatnym na denaturację, jest produkowany w postaci suchych ziaren i chłonie dużo wody,np. G-2 chłonie 0,2g wody) i Bio-Gel (poliakryloamid spolaryzowany-odporny na zakażenia). Proces rozdziału trzeba prowadzić pod stałym ciśnieniem. Układ jest zamknięty, stosuje się pompy perystaltyczne, za pomocą których podaję się płyn. Należy zrównoważyć kolumnę buforem czyli równoważyć pH buforu wprowadzonego do kolumny i pH roztworu w kolumnie. Błękit dekstranowy stosowany jest do pomiaru objętości pustej kolumny. Nanosimy białko do kolumny i odbieramy równomierne frakcje, w których oznacza się absorbancję przy 280 nm (aminokwasy, aromatyczne) i przedstawiamy zależność E280 w kolejnych frakcjach od numeru frakcji (otrzymujemy wykres w postaci pików-wysokość pików odpowiada objętości eluacyjnej). Możemy oznaczyć aktywność enzymu w każdej frakcji lub aktywność sumaryczną i wtedy znajdujemy pik z tym konkretnym enzymem.
(2)chromatografia jonowymienna na roślinach naturalnych i syntetycznych. Złoże jest kationem czyli naładowane (+). Na zasadzie oddziaływań Kulombowskich. Białka mogą wiązać się słabiej lub mocniej, w przypadku kationów wiążą się białka w formie anionowej. Białka muszą posiadać pH>pI. Nanosimy białka w odpowiednim buforze, a potem je wyekludujemy. Białka, które są związane musimy wyprzeć z kolumny, więc stosujemy ekluenty o wyższej sile jonowej czyli bufory o wyższej sile jonowej.
(3)chromatografia hydrofobowa na zasadzie oddziaływań-na kolumnę nanosisię roztwór białka w soli NH4SO4 o dużych stężeniach. Białka mają powinowactwo do nośnika. Eluację prowadzimy w malejącym gradiencie soli.
(4)chromatografia przez powinowactwo-zachodzi tu specjalna sorpcja. Ligandem może być inhibitor kompetencyjny. Może to być analog substratu (wykazuje powinowactwo do centrum aktywnego). To może być Co‑enzym np. NAD, FAD. W przypadku białek allosterycznych ligand może dopasowywać się do centrum aktywnego i allosterycznego. Jest to bardzo efektywna metoda. Tu kolumny zawierają jopny Ni, które kompleksją z resztami histydyny. Aby oddzielić białko możemy wprowadzić do jego geny metkę histydynową na N lub C końcu. Takie strategie stosuje się w przypadku enzymów rekombinatowych. To ułatwia jego izolację i szybszą biosyntezę. Tworzy się sorpcja z jonami N.
(5)chromatografia kowalencyjna-kowalencyjne wiązanie białka dzięki występowaniu mostków disiarczkowych. Rozdzielamy grupy tiulowe w białku, bardzo wydajna technika.
(6)chromatografia adsorpcyjna,
(7)chromatografia na matrycach ze związanymi jonami metali ciężkich.
...
liliw