Biotechnologia 5.doc

Biotechnologia 5

SZTUCZNE NASIONA

Istnieją dwie podstawowe technologie produkcji sztucznych nasion, różniące się stopniem uwodnienia materiału roślinnego:

1.      pierwsza wykorzystuje materiał uwodniony, natomiast druga wymaga dehydratacji materiału roślinnego. Odwodniony materiał jest otoczkowany w hydrożelach lub zatapiany w płynnym żelu syntetycznym.

2.      z kolei odwodniony materiał może być pokrywany syntetycznym polioksyetylenem i suszony strumieniem powietrza lub bez udziału żelu bezpośrednio suszony o eksykatorze

CO ROZUMIEMY PRZEZ POJĘCIE SZTUCZNE NSIONA?

Obecnie termin ten oznacza szersze niż tylko zarodki somatyczne  i obejmuje układ składający się z zaczątka rośliny (pąk wierzchołkowy lub włośnikowy, grudki kalusa embriogennego) umieszczonego w osłonce ochraniająco-odżywczej, zdolnego do regeneracji roślin na skalę komercyjną. System produkcji sztucznych nasion gwarantuje zachowanie genetycznej jednolitości potomstwa i zapewnia uzyskanie w porównaniu z mikrorozmnażaniem niezwykle dużego współczynnika rozmnażania.

Sztuczne nasiona:

·         pozbawione otoczki zarodki somatyczne poddane procedurze wysuszenia (odwodnienie)

·         otoczkowanie zarodki podczas desykacji (odwodnienie)

·         uwodnione zarodki (merystemy wierzchołkowe) otoczkowane kapsułą z żelu !!!

·         otoczkowane zarodki zanurzone w płynnym żelu

Potencjalne znaczenie:

Znaczenie takich nasion w ogrodnictwie, rolnictwie i leśnictwie jest ogromne i wynika z właściwości jakimi charakteryzuje się dobry materiał siewny wolny od patogenów, nadający się do długotrwałego przechowywania, łatwy w transporcie. Za pomocą tej techniki można namnażać materiał elitarny roślin mieszańcowych lub roślin, których namnażanie w sposób tradycyjny jest niemożliwe lub utrudnione. Mogą to być rośliny transgeniczne, odmiany segregujące.

Otoczkowanie nasion:

·         unieruchomienie fragmentu tkanki

·         zminimalizowanie funkcji życiowych

·         ochrona przed niekorzystnymi czynnikami środowiska

·         ochrona przed utlenianiem i destylacją

·         ochrona przed uszkodzeniami mechanicznymi podczas transportu i siewu

·         możliwość wprowadzenia regulatorów i mikroflory, pestycydów

Pochodzenie hydrożeli:

·         polisacharydowe (najczęściej stosowane)

·         organiczne żele (poliakrylamidowe)

·         żele białkowe (żelatyna, polimer glutaraldehydowy lub formaldehydowy)

Pochodzenie chemiczne wiązań żeli funkcjonujących:

·         żele powstają przez krzyżowe wiązania jonowe odpowiednio naladowanych polimerów (alginian, chizotan, karaginian)

·         żele powstają dorgą zmiennej lub gorącej polimeryzacji (agar, agarowa, karaginian)

·         żele powstają droga chemicznej reakcji (poliakrylamidy, formaldehydy)

Agar – polisacharyd ekstrahowany z różnych gatunków dużych czerwonych wodorostów

Otoczki alginianowe:

·         alginiany otrzymywane są z ogromnych brązowych alg morskich Macrocytis i Laminaria drogą ekstrachowania zasadą sodową dają alginian sodu.

·         Kiedy jiny Na+ zastąpimy jonai dwuwartościowymi, np. Ca2+, Ba2+, Sr2+, Zn2+, Al3+ tworzy się siec polimerowa pomiędzy jonami. Powstają wiązania krzyżowe miedzy grupami karboksylowymi a molekułami polisacharydowymi. Proces jest termoniezależny i bardzo dobrze w strukturę żelu dopasowuje się wapń.

Procedura postępowania:

·         Suspensje komórek miesza się w temperaturze pokojowej ze sterylnym roztworem alginianu sodu 2-3%

·         Nastepnie mieszaninę wkrapla się do  roztworu chlorku wapnia (50-300 mM CaCl2)

·         Perełki o określonej średnicy (0,5-5mm) utwardza się przez kilkanaście minut do kilku godzin

·         Powleka się je dodatkowo warstwą hydrofobową

·         Na etapie kiełkowania otoczki rozpuszcza się w  EDTA lub buforze cytrynianowym (fosforanowym)

Kiełkowanie i konwersja

Kiełkowanie  - oznacza zdolność do formowania korzonka zarodkowego

Konwersja – to róznoczesty rozwój korzonka zarodkowego i merystemu pędu z wytworzeniem rośliny o fenotypie właściwym dla danego garunku

Otoczki karaginianowe

Otrzymywane z komórek czerwonych wodorostów typu Chondrus, Euchemia, Gigatrina

Procedura pozyskiwania:

·         25% roztworu karaginianu podgrzewa się do temperatury 450C, a po schłodzeniu miesza się w/w roztwór z suspensja komórek

·         Następnie wkrapla się zawieszone w karaginianie komórki do roztworu KCl (kąpiel utwardzająca)

·         Perełki 2-4mm utrzymuje się w KCl przez 1-5h

Inne otoczki:

·         Celuloza i jej pochodne

·         Chitozan !!!

·         Żelifikujące gumy

·         Pektyny

·         Podwójne otoczkowanie (np. alginiany, pektyniany)

·         Najnowsze otoczki hydrofobowe

·         Tulanox®

·         Cab-o-sil®

·         Elwax® 426, 310, 410 (kolipolimer etyleno-winylooctowy)

·         Biokapsuły!!!! (osłonki zaindukowane wokół zarodka somatycznego , imitujące osłonkę nasienną z kutikulą)

Efektywność maszyny do otoczkowanie

·         500 000 sztucznych nasion o średnicy 80nl dziennie

·         Maszyna otoczkuje zarodki somatyczne pomidorów, bawełny, petunii i ogórka, sałaty, papryki, tytoniu

Masowe nasadzenie kultur in vitro

Pinus radiata – Nowa Zelandia

Sequoia sempervirens – Francja

Daglezja – Kanada, USA

Abies alba – Dania

Morwy

Drzewa sandałowe

Uratowano wiele roślin reliktowych , np. tysiącletnie okazy cyprysów (Upressus dupreziana, rzadkie eukaliptusy, sekwoje)

Rodzaje nasion:

·         Ortodoks – genotypy, które można poddać wysuszeniu

·         Rekalcitrant – genotypy bardzo wrażliwe (nie tolerują wysuszenia

W fazie dojrzewania zarodki somatyczne poddawane są  działaniu ABA

Etapy wytwarzania sztucznych nasion:

·         Uzyskanie i namnażanie materiału wyjściowego

·         Dojrzewanie i hartowanie (przygotowanie materiału  do suszenie i otoczkowanie). GA3 i ABA zapewniają prawidłowy wzrost zarodka , odporność na dehydratację oraz zapobiegają przedwczesnemu kiełkowaniu. Hartowanie polega na osuszeniu lekkim schłodzeniu.

·         Odwadnianie – eksykator lub glikol polietylenowy

·         Otoczkowanie – otoczka pełni funkcję „sztucznego bielma”, a dodatkowo osłonka hydrofobowa „okrywę nasienną”

·         Wysiew – w zależności od typu sztucznych nasion, przenosi się je do warunków in vitro w celu dalszego przechowywania lub wysiewu do gruntu in vitro

Etapy wytwarzania sztucznych nasion

Roślina macierzysta

↓

Eksplantat

↓

Indukcja i proliferacja kalusa embriogennego

↓

Namnażanie komórek w zawiesinie embriogennej

↓

Synchronizacja stadiów embriogenezy i hartowanie zarodków somatycznych

↓

Filtrowanie

↓

Suszenie

↓

Otoczkowanie

↓

Wysiew sztucznych nasion in vivo lub in vitro

Koszty produkcji:

Cena 1 nasiona lucerny:

·         Bioreaktor (pełna automatyzacja) – 0,00026$

·         Ręczne otoczkowanie – 0,068$

Kawa:

·         Interesująca cena  100 razy wyższa

·         Produkcja roczna za 12 bilionów$ (60 mln worków) głównie C. arabica i C. canephora

·         Kawa należy do roślin ortodoks

Problemy technologii sztucznych nasion:

1.      Indukcja zarodków somatycznych( dodatek różnych substancji m.in. aminokwasów)

2.      Faza dojrzewania zarodków i konwersji → podstawa ABA

3.      Problem O2

4.      Wysychanie otoczek

5.      Stopniowe uwodnienie nasion !!!

6.      Koszty produkcji

7.      Próby wytworzenia Bio-kapsuł

Ze względu na fazę wdrożeniową na dzien dzisiejszy namnaża się przez sztuczne nasiona : hybrydy ryżu, geranium, europejskie odmiany ogórka, gerberę, kawę, lucernę.

Potencjalne korzyści:

·         Szybkie namnażanie pożądanej linii

·         Gwarancja genetycznej jednolitości roślin

·         Bezpośrednie transplantowanie tkanki do gleby

·         Dostarczanie i namnażanie zmiennych (niestałych) genotypów takich jak rośliny transgeniczne o wysokiej niestabilności genetycznej

·         Dostarczanie sterylnych linii

·         Redukcja kosztów związanych z wegetatywnycm rozmnażaniem linii elitarnych

·         Możliwość masowej produkcji tkanki embriogennej z Komorek poddanych inżynierii genetycznej

·         Szybkie potwierdzenie transformacji genetycznej w regenerowanych roślinach

·         Możliwość wykorzystanie embrionów do kriokonserwacji w ciekłym azocie najlepszych linii produkcyjnych lub jako materiał do banku genów

BANKI GENÓW

Przechowywanie materiału roślinnego:

1.      Krótkoterminowe – przechowywanie materiału roślinnego w niskiej temperaturze (ok. 40C) przy niskim natężeniu światła i na ubogich pożywkach

2.      Długoterminowo:

·         W temperaturze – 700C zamrożenie przemian metabolicznych chociaż istnieje niebezpieczeństwo powolnego utlenienia tłuszczów oraz wzrost ilości mikrokryształów lodu w komórkach

·         W temperaturze -1960C (temperatura ciekłego azotu) komórki przez wiele lat nie tracą żywotności

Przechowywanie komórek in vitro w bankach genów

Proces wieloetapowy, który obejmuje etapy:

1.      wzrost wstępny

2.      krioprotekcja (krioprezerwacja)

3.      zamrażanie

4.      przechowywanie właściwe (-1960C)

5.      odmrażanie

6.      przywrócenie właściwego tępa wzrostu komórką

Krioprezerwacja zapewnia zachowanie stabilności genetycznej materiału na bardzo długi okres czasu stąd z powodzeniem stosowana jest do przechowywanie tkanek roślinnych , sztucznych nasion, roślin transgenicznych, ginących gatunków, itp.

Wzrost wstępny

Kultury prowadzi się na pozywka o obniżonym potencjale chemicznym wody (sacharoza, glukoza) oraz przy niskiej zawartości azotu (komórki są małe i słabo zwakuolizowane)

Krioprotekcja

Przed zamrożeniem usuwa się nadmiar wody z komórek i przestrzeni międzykomórkowych. Uzyskuje się ten efekt nasączając tkanki roztworami gliceryny, sacharozy, dwumetylosulfomianem DMSO, aminokwasem proliną lub glikolem polietylenowym. Możliwe jest łączenie krioprotektantów w formie 2 lub 3 składników.

Zamrażanie

1.      zamrażanie metoda konwencjonalną:

·         zamrażanie wstępne (od 0 do -400C). Optymalne tępo schładzania 0,5-20C/min. zależy od stopnia odwodnienia struktury i krystalizacji wody w karioprotektancie

·         zamrażanie właściwe

2.      Metoda odwodnienia:

·         Struktury roślinne ulegają odwodnieniu (dehydratacji) w temperaturze pokojowej

·         Zamrożenie w ciekłym azocie

3.      Metoda wutryfikacji:

·         Umieszczenie tkanki w silnie tężonych roztworach krioprotektantów (odciąganie wody od przestrzeni międzykomórkowych  i do roztworu)

·         Zamrażanie w ciekłym azocie

Odmrażanie:

...