kwasy nukleinowe 3.docx

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1.       Rozpuszczalność kwasów nukleinowych

Wykonanie ćwiczenia:

Część pierwsza: do 0,5 ml 0,1 % roztworów RNA i DNA dodać kroplami 1M HCl. Następnie dodawać kroplami NaOH. Część druga: do 1 ml 0,1 % roztworów RNA i DNA dodać 2 ml 96% etanolu. W obu przypadkach zanotować obserwacje.

Obserwacje:

- RNA + HCl – powstaje zmętnienie, które znika po dodaniu NaOH

- DNA + HCl – powstaje zmętnienie, które znika po dodaniu NaOH

- RNA + etanol i DNA + etanol – w obu przypadkach pojawia się biały delikatny osad

Wnioski:

Kwasy nukleinowe dobrze rozpuszczają się w środowisku zasadowym, słabo w wodzie, kwasach i alkoholach. W pierwszej części doświadczenia po dodaniu kwasu roztwory w probówkach zrobiły się mętne, co jest oznaką wytrącania się kwasów nukleinowych, gdyż w kwaśnym środowisku maleje ich rozpuszczalność. Dodanie zasady, czyli zobojętnienie środowiska podniosło rozpuszczalność kwasów nukleinowych, dzięki czemu zmętnienie w obu probówkach zanikło. W drugiej części doświadczenia po dodaniu alkoholu do probówek z kwasami nukleinowymi pojawił się osad, co jest spowodowane zmniejszeniem się rozpuszczalności tychże kwasów w obecności alkoholi.

2.       Kwaśna hydroliza kwasów nukleinowych

Wykonanie ćwiczenia:

2,5 ml 1 % roztworów DNA i RNA zmieszać z 2,5 ml 10 % kwasy siarkowego (VI). Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez godzinę.

Wnioski:

Po dodaniu kwasu siarkowego do probówek z kwasami nukleinowymi oraz po inkubacji we wrzącej łaźni wodnej zaobserwowaliśmy brak jakiegokolwiek zmętnienia. Jest to spowodowane rozpadem kwasów nukleinowych na wolne zasady purynowe i nukleotydy pirymidynowe. Dlatego też, pomimo kwaśnego środowiska, nie doszło do zmętnienia roztworów.

3.       Wykrywanie pentoz – reakcja orcynolowa

Wykonanie ćwiczenia:

Do każdej z 6 probówek zawierających po 1 ml jednej z określonych substancji (hydrolizaty i 0,1 % roztwory DNA i RNA oraz 1 % roztwory rybozy i deoksyrybozy) dodać po 1 ml odczynnika orcynolowego i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut. Po wyjęciu z łaźni i ostudzeniu dodać po 5 ml wody destylowanej (do rozcieńczenia barwy, niekoniecznie) i określić barwę roztworu.

Obserwacje:

- dla hydrolizatu RNA – barwa zielona roztworu

- dla hydrolizatu DNA – barwa zielona roztworu

- dla 0,1 % roztworu RNA – barwa zielona roztworu

- dla 0,1 % roztworu DNA – barwa zielona roztworu

- dla 1 % roztworu rybozy – barwa zielona roztworu

- dla 1 % roztworu deoksyrybozy – barwa zielona roztworu

Wnioski:

Pentozy wolne i związane w nukleozydach, ogrzewane w środowisku kwaśnym przechodzą w furfural, który z orcyną i jonami Fe3+ dają trwały kompleks o barwie zielonej. Reakcja zaszła we wszystkich trzech próbach potwierdzając obecność w nich pentoz.

4.       Wykrywanie pentoz – reakcja Dischego

Wykonanie ćwiczenia:

Do każdej z 6 probówek zawierających po 1 ml jednej z określonych substancji (hydrolizaty i 0,1 % roztwory DNA i RNA oraz 1 % roztwory rybozy i deoksyrybozy) dodać po 2 ml odczynnika difenyloaminowego i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.

Obserwacje:

- dla hydrolizatu RNA – bezbarwny, klarowny roztwór

- dla hydrolizatu DNA – barwa niebieska roztworu

- dla 0,1 % roztworu RNA – bezbarwny, klarowny roztwór

- dla 0,1 % roztworu DNA – barwa niebieska roztworu

- dla 1 % roztworu rybozy – bezbarwny, klarowny roztwór

- dla 1 % roztworu deoksyrybozy – barwa niebieska roztworu

Wnioski:

W środowisku kwaśnym deoksyryboza przechodzi w aldehyd hydroksylewulionowy, który następnie kondensuje z difenyloaminą, tworząc niebieski produkt. Jest to reakcja charakterystyczna na wykrycie deoksyrybozy, czyli cukru występującego w DNA i jego hydrolizacie.

5.       Wykrywanie kwasu fosforowego

Wykonanie ćwiczenia:

Do 0,5 ml hydrolizatu DNA lub RNA (przeprowadziłem obie reakcje) dodać 3 krople roztworu amoniaku. Następnie dodać 0,5 ml stężonego roztworu HNO3 i 2 ml roztworu molibdenianu amonowego. Zawartość probówki ogrzać do wrzenia.

Obserwacje:

- dla hydrolizatu DNA – żółty osad, żółta barwa roztworu

- dla hydrolizatu RNA – żółty osad, żółta barwa roztworu, zmętnienie

Wnioski:

Powstanie żółtego osadu świadczy o wytrąceniu się nierozpuszczalnego fosfomolibdenianu amonowego. Potwierdza to obecność kwasu ortofosforowego w próbach.

6.       Wykrywanie puryn

Wykonanie ćwiczenia:

Do 1 ml hydrolizatu DNA lub RNA (przeprowadziłem obie reakcje) dodać 6 kropli stężonego roztworu amoniaku i 3 ml amoniakalnego roztworu azotanu srebra.

Obserwacje:

- dla hydrolizatu DNA – powstał kłaczkowaty biały osad

- dla hydrolizatu RNA – powstał kłaczkowaty biały osad

Wnioski:

Sole zasad purynowych z metalami ciężkimi (np. Ag) w środowisku kwaśnym wytrącają się w postaci krystalicznej. Powstanie osadu w obu probówkach świadczy o obecności puryn w próbach. Powstałym związkiem (osadem) jest sól srebrowa puryny (adeniny lub guaniny).

7.       Oznaczanie zawartości zasad purynowych metodą spektrofotometryczną

Wykonanie ćwiczenia:

Do 5 g kostki bulionowej (bulion cielęcy Knorr) dodać około 75 ml wody destylowanej, gotować we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut, a następnie po wystudzeniu przesączyć do kolby miarowej o pojemności 100 ml przez gazę młyńską i uzupełnić do kreski wodą destylowaną. Po lekkim wystudzeniu przesączyć roztwór przez sączek z bibuły i rozcieńczyć 0,1 M HCl 20-krotnie (0,5 ml roztworu na 19,5 ml kwasu). Dla tak przygotowanych próbek zmierzyć wartości absorbancji przy trzech długościach fali: 249, 262 i 290 nm. Te wartości pozwalają odnotować różnice w zabarwieniu poszczególnych roztworów.

Część praktyczna doświadczenia:

- dla adeniny (roztwór standardowy): ΔE(262-290) = 0,900

- dla guaniny (roztwór standardowy): ΔE(262-290) = 0,457

Tabela 1 – Różnice ekstynkcji dla roztworów badanych

Przykład obliczeń zawartości zasad azotowych w kostkach spożywczych wyróżnionych w tabeli kolorem czerwonym:

Dla adeniny:

Dla guaniny:

Tabela 2 – Zawartość zasad azotowych w poszczególnych kostkach spożywczych