IZOLACJA Z GLEBY:
a. Bezpośrednia:
- pobieramy kilka próbek z różnych miejsc odległych od siebie o 5-6 metrów
- indywidualne próby umieszczamy w pojemnikach oddychających
- w laboratorium próby indywidualne łączymy w próbę zbiorczą
- dokładnie mieszamy
- izolacja jedną z następujących metod:
o wykładanie drobiny gleby na pożywkę w centrum płytki Petriego
o przemywanie próby gleby wodą i izolacja z zawiesiny komórkowej lub zarodnikowo-strzępkowej
o rozcieńczanie próby gleby i izolacja z mieszaniny rozcieńczalnika (woda, 1% agar lub olej mineralny w stosunku 1:10) i gleby (sterylny piasek kwarcowy)
b. Pośrednia:
- umieszczanie w glebie pułapek organicznych lub roślin pułapkowych
- izolowanie z pułapek zasiedlających je mikroorganizmów
- pułapki mogą być wprowadzane w rurkach szklanych lub metalowych z otworami bocznymi, przez które dochodzi do kolonizacji
- stosujemy w przypadku prób organicznych
- pobieramy fragment rośliny z częścią chorą i zdrową
- przepłukujemy
- sterylizujemy 96% alkoholem
- płuczemy w wodzie destylowanej
- suszymy między warstwami wyjałowionej bibułki w ciepłym powietrzu
- dzielimy na inocula
- wykładamy na pożywkę
- inkubacja 5-10 dni
- wyhodowane kolonie przeszczepiamy na skosy
IZOLACJA Z POWIETRZA
Metoda sedymentacji Kocha – polega na wyeksponowaniu płytki Petriego z pożywką w środowisku, które chcemy zbadać. Drobnoustroje ze środowiska będą opadały na płytkę, a po odstawieniu do inkubacji wytworzą się kolonie. Minimalny czas ekspozycji to 10 min, maksymalny – 60 min. Czas ekspozycji zależy od zanieczyszczenia i intensywności ruchu powietrza.
CFU (colony forming units) – liczba kolonii na płytce w określonej ilości zawiesiny
CFU = liczba kolonii * stopień rozcieńczenia * objętość próbki
KOMORA THOMA – szklana płytka z 2 wgłębieniami (głębokość 0,1 mm) i naniesioną siatką podzieloną na 16 dużych kwadratów o powierzchni 1/400 mm2. Każdy z tych kwadratów składa się z 16 małych kwadracików o boku 0,05 mm i objętości pod szkiełkiem nakrywkowym 1/4000 mm3. Komora Thoma służy do bezpośredniego liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem.
POŻYWKA – płynne lub zestalone mieszaniny odpowiednio dobranych składników służących do hodowli drobnoustrojów w warunkach sztucznych.
DOBRA POŻYWKA CHARAKTERYZUJE SIĘ:
- odpowiednią wartością odżywczą
- optymalnym odczynem
- odpowiednim ciśnieniem osmotycznym
- klarownością
- sterylnością
POŻYWKA ZAWIERA:
- węgiel (cukry proste i złożone)
- azot (związki nieorganiczne i organiczne)
- sole mineralne (siarczany, fosforany, chlorki żelaza, magnezu potasu, sodu i in.; właściwości buforujące i regulujące ciśnienie osmotyczne)
- czynniki wzrostowe (syntetyczne lub naturalne witaminy)
- składniki wybiórcze (antybiotyki, sole kwasów żółciowych, barwniki; tylko pożywki selektywne i specjalistyczne)
- czynniki zestalające (agar, żelatyna, żel krzemionkowy, białka jaj, surowica krwi)
PODZIAŁ POŻYWEK ZE WZGLĘDU NA:
A. DOBÓR SKŁADNIKÓW ODŻYWCZYCH:
- naturalne
- półsyntetyczne
- syntetyczne
B. ZAWARTOŚĆ SKŁADNIKÓW ODŻYWCZYCH:
- podstawowe
- wzbogacone
C. CEL:
- namnażające
- namnażajaco-wybiórcze
- identyfikacyjne
D. KONSYSTENCJĘ:
- płynne
- półpłynne
- stałe
PODŁOŻA:
a. hipotoniczne – o niższym ciśnieniu osmotycznym niż w komórkach drobnoustrojów (jest przyczyną pęcznienia i pękania komórek)
b. hipertoniczne – o wyższym ciśnieniu osmotycznym niż w komórkach drobnoustrojów (powoduje kurczenie się plazmy komórkowej i zjawisko plazmolizy)
c. izotoniczne – o właściwym ciśnieniu osmotycznym
PODŁOŻE CHAPMANA – pożywka wybiórczo różnicująca. Służy do izolacji gronkowca w warunkach beztlenowych. Elementem różnicującym jest manitol. W wyniku fermentacji manitolu i zakwaszenia środowiska pożywka zmienia kolor z różowego na żółty.
PODŁOŻE MACCONKEYA – pożywka wybiórczo-różnicująca. Elementem różnicującym jest laktoza. Kolor wyjściowy – bezbarwny. Różnicuje bakterie gram- na fermentujące laktozę i nie fermentujące laktozy. Bakterie fermentujące laktozę (Escherichia coli, Klebsiella) zakwaszają podłoże do pH<6,8. Dochodzi do zmiany barwy kolonii z bezbarwnych na czerwono-różowe.
- umożliwia dokładniejszą obserwację kształtu i budowy drobnoustrojów
- BARWNIKI:
o fuksyna – zaznacza kontury komórek,
o fiolet krystaliczny – zaznacza kontury barwionych komórek,
o fiolet goryczkowy,
o safranina,
o zieleń malachitowa,
o błękit metylenowy – różnicuje wewnętrzną strukturę komórek,
o erytrozyna (barwnik kwaśny) – barwienie preparatów z gleby; uwidacznia plazmę komórek drobnoustrojów ale nie wybarwia gleby
- BARWIENIE PROSTE – jeden barwnik; obserwacja kształtów
- BARWIENIE ZŁOŻONE – dwa lub wiece barwników, różne sposoby odbarwiania i utrwalania preparatów; różnicuje komórki i ich struktury wewnętrzne
SPOSÓB PRZYGOTOWANIA PREPARATU DO BARWIENIA
- Opalamy nad palnikiem szkiełko przedmiotowe i studzimy.
- Nakładamy kroplę wody.
- Umieszczamy odrobinę materiału hodowlanego w kropli wody.
- Wykonujemy rozmaz na dużej powierzchni szkiełka.
- Wysuszamy rozmaz na powietrzu.
- barwienie złożone
- pozwala wyróżnić gramdodatnie (fioletowe) i gramujemne (czerwone)
- polega na traktowaniu bakterii fioletem krystalicznym a następnie płynem Lugola i safraniną
- fiolet krystaliczny wybarwia bakterie gram+ i gram-
- płyn Lugola utrwala połączenie fioletu z gram+ (gram- odbarwiają się w alkoholu)
- safranina zabarwia gram- na czerwono
SPOSÓB POSTĘPOWANIA:
- Preparat utrwalamy przez trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika.
- Barwimy preparat roztworem fioletu krystalicznego.
- Tryskawką delikatnie zmywamy barwnik.
- Zalewamy preparat płynem Lugola.
- Zlewamy płyn Lugola.
- Spłukujemy preparat wodą.
- Otrząsamy z wody i zalewamy roztworem safraniny.
- Spłukujemy preparat wodą i osuszamy.
METODA SCHAFFERA-FULTONA
- polega na traktowaniu bakterii zielenią malachitową i safraniną
- barwienie przetrwalników (Bacillus i Clostridium)
- przetrwalniki barwią się tylko na gorąco
- zieleń malachitowa barwi protoplazmę przetrwalników na zielono
- safranina wybarwia protoplazmę komórek wegetatywnych na czerwono
- Studzimy utrwalony preparat.
- Barwimy preparat roztworem zieleni malachitowej.
- Nie zlewając barwnika, od spodu podgrzewamy preparat płomieniem palnika do trzykrotnego ukazania się pary.
- Spłukujemy preparat wodą do chwili ustania wymywania barwnika.
- Barwimy preparat roztworem safraniny.
Glomeromycota – GRZYBY MIKORYZOWE
- obligatoryjne symbionty
- arbuskule w komórkach korzeni
- grzybnia niepodzielna ścianami poprzecznymi
- zarodniki (chlamydospory):
o duże grubościenne
o tworzą się wewnątrz lub na zewnątrz korzenia
o pojedyncze, w skupieniach lub owocnikach
o od setek do kilku tysięcy jąder
- brak rozmnażania płciowego
Chytridiomycota – SKOCZKOWCE
- ...
beataanka1