Kultury in vitro cz zwierz.pdf

13 grudnia 2010

(podręczniki: Hodowla komorek i tkanek - red. Stokłosowa)

typy hodowli iv

hodowle tkankowe

narządów - fragmenty narządów lub całe organe np. embrionów, zachowana budowa tkanki (na

granicy faz pożywka/gaz)

hodowle eksplantów (fragmenty tkanek)

hodowle organotypowe i przestrzenne (różne typy komórek w różnych układach przestrzennych tak

by odtworzyć budowe histologiczną jakiegoś narządu)

komórkowe = komórki budujące tkankę są rozszczepione mechanicznie lub enzymatycznie i

hodowane w zawiesinie lub przyczepione do podłoża (w postaci pojedynczych komórek)

Zastosowanie hodowli komórkowych i tkankowych

badania podstawowe

funkcjonowanie komórki

zastosowanie praktyczne m. in.

toksykologia

inżynieria tkankowa - , skóra, tkanka kostna, chrzęstna

produkcja związków biologicznych: przeciwciała monoklonalne, hormony, enzymy

inne

wpływ czynników pozakomórkowych: sygnalne, patogenne, stresowe, leki

kontrolowana ekspresja genów, transfekcja

cykl komórkowy: proliferacja, różnicowanie, apoptoza, transformacja

sekrecja

zalety

ściśle określony, homogenny typ komórek

kontrolowane, łatwe do manipulacji warunki wzrostu

łatwy dostęp do poszczególnych komórek

możliwość uzyskania dużej liczby komórek

ograniczenia

uproszczony model w stosunku do naturalnych tkanek

ograniczony czas życia niektórych linii komórkowych

niestabilność fenotypowa i genetyczna (dotyczy tych nieśmiertelnych)

wysokie wymagania dotyczące sterylności

kosztowne zaplecze sprzętowe i odczynnikowe

Pożywki

funkcje pożywek

dostarczają elementów odżywczych, aa, cukrów, kwasów tłuszczowych, pierwiastków śladowych,

soli, witamin i kofaktorów

utrzymują odpowiednie środowisko fizykochemiczne: pH, ciśnienie osmotyczne

wybór odpowiedniej pożywki i suplementów wpływa zasadniczo na

Pożywki naturalne: limfa, surowica, ekstrakt z zarodków kurzych

Pożywki obecnie stosowane

pożywki podstawowe

pożywki pełne= podstawowe + surowica (czynniki wzrostu, hormony

najczęściej stosowane: Eagle's Basal Medium (BME)

Eagle's Minimum (MEM)

DMEM (modyfikacja dulbecco BME

RPMI 1640

Optymalizacja pożywek dla różnych typów kom

Pożywki bez surowicy SFM (serum free medium)

aby uniknąć niebezpiecznych czynników infekcyjnych

produkcji na skalę masową

ułatwienie w obróbce materiału (np. izolacja bialek

większa powtarzalność i możliwość standaryzacji

Właściwości fizyko-chemiczne pożywek

7,4 optimum dla więszości (fibroblasty 7,4-7,7

transformowane (7,0-7,4

indykator pH pożywki - fenol red: żółty pomoarańczowy, czerwony , różowy, purpurowy

CO2 powoduje zakwaszanie pożywki

buforowanie :przez dodanie wodoorowęglanów (tani, ale słabe); HEPES (duża pojemność

buforowa, ale bardzo drogi)

komórki powinny być hodowane w odpowiedniej atm. co2 w zależności od typu pożywki, rodzaju i

stężenia składnika buforującego, rodzaju naczyń hodowlanych (zamknięte, otwarte)

tlen

komórki w hodowli w przeciwieństwie do komórek in vivo są anaerobowe i wykorzystują glikolizę

jako źródło energii

zapotrzebowanie na tlen jest różne w przypadku linii kom i hodowli organów

linie kom - tlen atm lub nawet niższe stężenie (surowica zwiększa tolerancję na tlen)

hodowle organów wymagają nieco wyższego stężenia O2

grubość warstwy pożywki ogranicza dostęp gazów (pt 2-5mm)

Lepkość i napięcie powierzchniowe nie mają zbyt dużego znaczenie, lepkość warunkowana jest

głównie przez surowicę, natomiast tworzenie piany (niskie napięcie pow) wpływa na możliwość

zanieczyszczeń

buforowanie przez dodanie wdw szybka alkalizacja pożywki poza inkubatorem, stężenia wdw i co2

muszą być w równowadze

buforowanie HEPESem umożliwia zredukowania stężeniu w naczyniach zamkniętych nie

wymagają podawania co2 (stęż. wdw na niskim poziomie)

Temperatura

optimum zależy od gatunku zwierzęcia, z którego pochodzi linia, usytuowanie tkanki (skóra i jądra

trochę niższa) ludzkie 37, ptasie 38,9 , ale 37 też dobrze tolerują

ssacze dobrze tolerują różnice temperatur poniżej optimum

kilka dni w temp. 4C, mogą być zamrażane i rozmrażane (-196)

Nie tolerują wzrost temp o 2 st (39, 5 umierają po kilku godzinach, 40 - nagła śmierć

Hodowle zmiennocieplnych (poikilotermiczne) 15-26st ( czyli że właściwie inkubator zbędny -

wystarczy pokój)

Pożywki podstawowe

pełne

BSS balanced salt solution

Podstawową wszystkich pożywek jest BSS sole nieorganiczne, wdw sodu

Sole Earle EBSS zaw. wysokie stęż wodorowęglanu sodu do hodowli w 5% Co2

sole Hanks'a (HBSS) do hodowli w zamkniętych naczyniach, co2 z powietrza

Ca2+

Jony dwuwartościowe, główne Ca wymagane przez cząsteczki decydujące o adhezji (kadheryny),

(w zawiesinie trzeba unikać, bo zaczynają tworzyć agregaty) Ca2 decyduje o tym, czy komórki

proliferują, czy różnicują się (wysokie stężenie hamuje proliferację)

Na, K, Cl

regulują potencjał błonowy, ciśnienie osmotyczne

Wybór BSS zależy od

stężenia co2,

rodzaju hodowli (zawiesina lub monolayer)

typ linii

glukoza - źródło energii - glikoliza

kwas mlekowy akumuluje się w pożywce (szczególnie w liniach embrionalnych i

transformowanych) cykl kwasu cytrynowego nie funkcjonuje poprawnie

większość C w cyklu kw. cytr. pochodzi z glutaminy - ważne źródło energii

Właściwości chemiczne pożywek

skład surowica

Osocze krwi pozbawione fibrynogenu. Ww czasie tworzenia skrzepu przez płytki krwi wydzielane

są do surowicy czynniki wzrostowe takie jak PDGF, FGF

czynniki wzrostowe, hormony, czynniki wpływające na adhezję, białka nośnikowe, minerały, lipidy,

węglowodany, witaminy.

Czynniki wzrostowe zawarte w surowicy

Działanie za pośrednictwem receptorów błonowych

Mogą być specyficzne w stosunku do danego typu komórki lub działać na różne typy komórek

np. PDGF (platelet-derived growth factor) główny czynnik wzrostu zawarty w surowicy, stymuluje

wzrost fibroblastów i komórek glejowych

działają w sposób zróżnicowany na różne komórki

np FGF-beta (fibroblast growth factor) indukuje wzrost fibroblastów, ale hamuje wzrost komórek

nabłonkowych i promuje ich różnicowanie

jeden typ komórek może być stymulowany kilkoma czynnikami wzrostu i np. fibroblasty są

stymulowane przez FHF, EGF, PDGF, i IGF-I

białka nośnikowe i wpływające na przyczepiane komórek do podłoża

Nośniki minerałów, kwasów tłuszczowych i hormonów

albumina - nośnik minerałów, kwasów tłuszczowych

transferyna - wiąże żelazo, czyniąc je mniej toksycznym i lepiej przyswajalnym

białka wpływające na przyczepianie kom. do podłoża

globuliny, fibronektyna, fetuina (w surowicach płodowych)

antyproteazy - hamują działania proteaz m. in. trypsyny. Zapobiegają proteolitycznemu

uszkodzeniu komórek i ich produktów białkowych (alfa 2 makroblobulina , alfa1-antytrypsyna)

Zwiększają leppkość pożywki i zmniejszają ryzyko uszkodzenia komórek

Hormony

insulina - zwiększa pobieranie glukozy i aa przez komórkę

hydrokortyzon promuje przyczepianie komórek do podłoża, przy wysokim stężeniu komórek może

mieć właściwości cytostatyczne i indukować różnicowanie komórek

najczęściej stosowane surowice cielęca (CS)

płodowa bydlęca (FBS) komórki bardzo wymagające, klonowanie

końska (HS) stabilniejszy skład

stężenie surowice w pożywce 5-20%

Brak surowicy powadzi do apoptozy komórek prawidłowych. Komórki unieśmiertelnionych i

transformowane nie wymagają obecności surowicy lub znacznie mniejsze jej stężenie.

Wady użycia surowicy

dla większości komórek surowica nie jest płynem fizjologicznym z którym się stykają

duża zmienność składu pomiędzy różnymi partiami wymaga analizy składu, może zawierać różne

stężenia czynników wzrostu

ryzyko zanieczyszczeń: wirusy grzyby, mykoplazma

Wady i zalety użycia SFM

zalety

standaryzacja składu

łatwiejsze oczyszczanie produktów

możliwość dobrania warunków dla selektywnego wzrostu określonych komórek w hodowlach

pierwotnych

możliwość uniknięcia nadmiernej proliferacji fibroblastów w hodowlach pierwotnych

wady

są bardziej specyficzne dla określonych typów komórek, nieekonomiczne

niewiele rodzajów dostępnych na rynku

mniejsza tolerancja hodowli na zmiany fizykochemiczne - wymagana precyzyjna kontrola pH i

temp.

wolniejszy wzrost komórek

maksymalna liczba podziałów linii o określonym czasie życia jest mniejsza

W zależności od sposobu wzrostu

linie adherentne

linie rosnące w zawiesinie

Komórki linii adherentnych wymagają do wzrostu specjalnej powierzchni, muszą pryzczepiać się

do podłoża ekspresja fenotypu fizjologicznego

Powierzchnia naczyń do hodowli modyfikowana: naładowane grupy na powierzchni szalki

powierzchnia pokrywana kolagenem lub poli-D-lizyną

Materiał biologiczny do przygotowania linii pierwotnej: embriony mysie, kurze

materiał biopsyjny ludzki

rozcinanie i rozpraszanie - dyfuzja, enzymatyczne rozproszenie(trypsyna, kolagenaza, elastaza,

pronaza, DNAza, hialuronidaza), mechaniczne rozszczepienie

Hodowle pierwotne (primary cultures) po izolacji komórek przed pierwszym pasażem. składa się z

różnych rodzajów komórek

Hodowle pierwotne

z tkanek prawidłowych. aby rosnąć muszą się przyczepić do podłoża

z tkanki nowotworowej W większości mogą rosnąć w hodowlach płynnych

W wyniku pasażu hodowli pierwotnej otrzymujemy linię komórkową (również heterogenne, ale nie

tak bardzo jak hodowla pierwotna)

Klonowanie

Linie komórkowe są bardziej homogenne niż hodowle pierwotne na skutek selekcji

Linie komórkowe pochodzące z pojedynczej komórki to klonalne linie komórkowe

Proces ich wyprowadzania to klonowanie

Rozcieńczanie inokulum i wprowadzanie do naczynia pojedynczych komórek

hodowla w specjalnych kapilarach lub dołkach plastykowych płytek

Hodowla w naczyniach pokrytych komorkami odżywczymi ang. feeder layer (zahamowany wzrost

- naświetlanie lub mitomycyna), które są źródłem składników odżywczych, czynników wzrostuu,

składników macierzy zewnątrzkomórkowej

Komórki rosnące w zawiesinie hoduje się w pożywce półpłynnej zmieszanej z agarem lub agarozą

Linie o skończonym czasie życia

wyprowadzone z prawidłowych komórek

określony okres przeżywania (liczba pokoleń) , po którym starzeje się i obumiera około 20-80

podwojeń populacji

odzwierciedla naturalny proces starzenia in vivo

czas życia komorek w linii zależy od wieku organizmu, z którego pobrano komórki linie

wyprowadzone z embrionów żyją dłużej niż wyprowadzone z organizmów dorosłych

Limit Hayflick'a

Komórki linii wyprowadzonej z tkanek prawidłowego embriona obumierały po ok. 50 pokoleniach

kontrola senescence (starzenia)

Skończona liczba podziałów jest regulowana przez grupę co najmniej 10 genów które negatywnie

regulują progresję cyklu komórkowego. Prawdopodobnie negatywnie regulują ekspresję genu

telomerazy.

Linie ciągłe - linie wyprowadzone z komórek nowotworowych lub z komórek prawidłowych

unieśmiertelnionych lub transformowanych.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: