antybiotyki.doc

1. pojecia:

antybiotyki- naturalne, wtórne produkty metabolizmu drobnoustrojów, które działając wybiórczo w niskich stężeniach wpływają na struktury komórkowe lub procesy metaboliczne innych drobnoustrojów hamując ich wzrost i podziały.

chemioterapeutyk- jest to rodzaj substancji chemicznej stosowany w leczeniu chorób zakaźnych. Dokładniej są to leki przeciwdrobnoustrojowe otrzymane na zasadzie całkowitej syntezy chemicznej, nie posiadające swojego odpowiednika w przyrodzie.

Inokulum –liczba komórek bakteryjnych w podłożu płynnym wyrażana jako liczba jednostek tworzących kolonię na mililitr. Może być również określana jako zmętnienie lub gęstość optyczna zawiesiny bakteryjnej.

Efekt inokulum - zjawisko obniżenia skuteczności antybiotyków ze względu na zwiększoną liczbę (inokulum) bakterii. Oporność na antybiotyki (zwłaszcza beta-laktamy) często polega na wytwarzaniu enzymu inaktywującego lek, a zwiększona jego ilość jest przyczyną powstania tego efektu.

MIC- Jest to najmniejsze stężenie środka bakteriobójczego (antybiotyku lub chemioterapeutyku), wyrażone w mg/l, hamujące wzrost drobnoustrojów (odnosi się zazwyczaj do bakterii i grzybów)

MBC- Jest to najmniejsze stężenie środka bakteriobójczego (antybiotyku lub chemioterapeutyku), wyrażone w mg/l, oznaczone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% drobnoustrojów (odnosi się zazwyczaj do bakterii i grzybów).

Antybiogram podstawowy – zawiera antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu.

Antybiogram  rozszerzony- zawiera rozszerzoną listę antybiotyków stosowanych wobec drobnoustrojów wieloopornych i/lub izolowanych z ciężkich zakażeń.

oporność krzyżowa- oznacza niewrażliwość na na wszystkie lub niektóre antybiotyki  należące do tej samej grupy chemicznej (np. antybiotyki  β-laktamowe, amino glikozydy, makrolity) lub czasem nie spokrewnionej grupy chemicznej, gdy miejsa uchwytu dla antybiotyków znajdują się blisko siebie (np.opornośc na makrolity i linkozamidy). Mechanizmy oporności wynikające z barku przepuszczalności błony komórkowej lub aktywnego wypompowywania leku z komórki mogą powodować oporność na więcej niż jedną grupę chemiczną, zjawisko to jest niekiedy określane  jako oporność skojarzona.

Oporność kliniczna- brak skuteczności leczniczej danego leku pomimo braku oporności farmakologicznej (a nawet mikrobiologicznej) u danego mikroorganizmu. Może ona wynikać np. z osobniczej zdolności pacjenta do rozkładu leku w większym stopniu niż przeciętna w populacji, stosowania innych leków, które niekorzystnie wpływają na działanie antybiotyku itd.

Oporność  naturalna- stała cecha grupy, rodzaju drobnoustrojów:

Naturalna oporność wynika z :

1.braku w komórce bakteryjnej celu („receptora”) dla danego antybiotyku  lub niskiego powinowactwa do niego (antybiotyki β-laktamowe – Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, cefalosporyny i penicyliny izoksazolilowe – Enterococcus spp.),

2.braku lub niskiej penetracji/transportu antybiotyku przez ścianę komórkową (makrolidy, glikopeptydy –Enterobacteriaceae, amino glikozydy – Enterococcus spp., Streptococcus spp.),

3.wytwarzania enzymu inaktywującego antybiotyk (karbapenemy – karbapenemaza zależna od jonów cynku u Stenotrophomonas maltophilia).

Oporność nabyta- nowa cecha szczepu wynikająca ze zmian  materiału genetycznego.

dyspenser.

2. mechanizm działania

Działanie antybiotyków polega na powodowaniu śmierci komórki bakteryjnej (działanie bakteriobójcze) lub wpływaniu w taki sposób na jej metabolizm, aby ograniczyć jej możliwości rozmnażania się (działanie bakteriostatyczne).

Antybiotyki zazwyczaj zakłócają pewne procesy metaboliczne. Głównym ich atutem jest specyficzność działania. Nietrudno jest zabić 100% bakterii – można to zrobić silnym promieniowaniem, wysoką temperaturą lub ekstremalnym pH środowiska. Takie procesy zabiłyby również niechybnie pacjenta. Podstawą terapii antybiotykami jest zasada selektywnej toksyczności Ehrliha, zgodnie z którą, antybiotykiem jest substancja, która w organizmie, w stężeniu nie wykazującym większej toksyczności dla ludzi i zwierząt wyższych, powoduje uszkodzenie lub śmierć drobnoustrojów. Można to osiągnąć przez stosowanie substancji oddziałujących na takie struktury, które są obecne w komórkach drobnoustrojów, a których nie ma w organizmie człowieka lub występują w nim w innej formie.

Główne mechanizmy działania antybiotyków to:

·         Zakłócanie syntezy ściany komórkowej bakterii np. penicylina

·         Upośledzenie przepuszczalności błony komórkowej bakterii. np. Gramicydyna

·         Zakłócanie syntezy kwasów nukleinowych:

o        hamowanie biosyntezy folianów niezbędnych do syntezy DNA

o        hamowanie na różnych etapach np. Trimetoprim

o        hamowanie działania topoizomeraz np. Ciprofloksacyna

·         Zakłócanie syntezy białek np. Streptomycyna

Osobnym problemem jest szkodliwość dla naturalnej flory bakteryjnej człowieka.

zakres działania

Każdy antybiotyk charakteryzuje określone spektrum przeciwbakteryjne, tzn. zakres działania na drobnoustroje, na które wywiera on swój wpływ w stężeniach względnie nieszkodliwych dla organizmu gospodarza.
Ze względu na zakres działania przeciwbakteryjnego antybiotyki dzieli się na dwie zasadnicze grupy.
1. Antybiotyki o wąskim zakresie działania przeciwbakteryjnego obejmujące swoim wpływem niewielką liczbę rodzajów drobnoustrojów, przy czym działanie to jest skierowane głównie na:
a) drobnoustroje Gram-dodatnie (penicyliny naturalne ? krystaliczna, prokainowa, fenoksymetylowa, benzatynowa; makrolidy ? erytromycyna, tylozyna, oleandomycyna, spiamycyna; linkomycyna);
b) drobnoustroje Gram-ujemne (aminoglikozydy ? streptomycyna, neomycyna, kanamycyna, gentamycyna);
c) grzyby (gryzeofulwina, nystatyna, amfoteracyna B i inne);
d) pierwotniaki (trychomycyna, fumagilina).
2.Antybiotyki o szerokim zakresie działania, wpływają na względnie dużą liczbę różnych drobnoustrojów. Są to zarówno drobnustroje Gram-dodatnie i Gram-ujemne, jak i bedsonie oraz riteksje i pierwotniaki (tetracykliny, chloramfenikol, amipicylina).

4. metody oznaczania wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki (zasady

metody, wykonanie, interpretacja i odczyt)

JAKOŚCIOWE

- Oznaczanie lekooporności metodą krążkowo-dyfuzyjną Kirby‑Bauera

Metoda krążkowo-dyfuzyjna Kirby-Bauera jest oparta na dyfuzji antybiotyku zawartego w krążku do podłoża. Antybiotyk dyfunduje promieniście przez agar, tworząc gradient stężeń. Największa jego koncentracja występuje przy brzegach krążka i spada wraz z odległością od krążka. Wielkość strefy zahamowania wzrostu bakterii jest wprost proporcjonalna do stopnia wrażliwości bakterii na antybiotyk - im większa jest strefa zahamowania, tym bakteria jest bardziej wrażliwa.

W zależności od wielkości strefy, bakterie określa się jako: wrażliwe, średnio wrażliwe lub oporne na podstawie przyjętych standardów (M100-S10NCCLS, 2000). Metoda krążkowo-dyfuzyjna jest najczęściej używaną metodą testowania lekooporności. Jest ona dobrze wystandaryzowana, powtarzalna, relatywnie tania. Posiada jednak ograniczenia. Nie jest wiarygodna w testowaniu wolno-rosnących organizmów, bezwzględnych bakterii beztlenowych. Niektóre antybiotyki słabo dyfundują w agarze, przez co różnica w strefach zahamowania dla bakterii wrażliwych i opornych jest niewielka, co może prowadzić do nieprawidłowego określenia lekooporności (antybiotyki glikopeptydowe, polimyksyna B).

Materiały:

·         podłoże agar Mulera- Hinton (MHA2)

·         1 ml jałowej 0,85% soli fizjologiczna (NaCl)

·         krążki bibułowe z antybiotykiem – np. firma Oxoid

·         zawiesina bakteryjna – w skali 0,5 McFarlanda

·         wzorzec – 0,5 McFarlanda

·         jałowe wymazówki

Procedura przygotowania inoculum i interpretacja wyników

Inoculum przygotować ze świeżej, osiemnastogodzinnej hodowli bakterii na podłożu MHA2. Kilka kolonii bakterii zawiesić w jałowym fizjologicznym roztworze 0,85% NaCl, celem uzyskania zawiesiny o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, co w przybliżeniu odpowiada liczbie od 1 ´ 108 do 2 ´ 108 c.f.u./ml. Gęstość zawiesiny oznaczyć nefelometrycznie przy użyciu kolorymetru (Nr kat. V1210 firmy bioMérieux).

Gotową zawiesinę w ciągu 15 minut rozprowadzić na powierzchni podłoża MHA2 przy użyciu jałowej wymazówki. Po 15 minutach na posiane podłoże nakłożyc krążki z antybiotykami i chemioterapeutykami. Tak przygotowane płytki w ciągu następnych 15 minut wstawić do cieplarki i inkubowć w warunkach tlenowych 16-18 godzin, w temperaturze 37°C.

Wyniki interpretować zgodnie z zaleceniami NCCLS, według średnicy uzyskanych stref zahamowania wzrostu.

- metoda przeglądowa

ILOŚCIOWE

·         Metoda seryjnych rozcieńczeń na podłożu płynnym

Polega na przygotowaniu serii probówek z płynnym podłożem wzrostowym dla bakterii. Do probówek dodaje się badanego środka bakteriobójczego w odpowiednich, malejących stężeniach. Następnie do każdej probówki dodaje się taką samą ilość zawiesiny danego drobnoustroju z hodowli. Po 16-18 godzinnej inkubacji w temperaturze 35°C sprawdza się, w których probówkach rozwinęły się hodowle (obserwuje się zmętnienie w probówkach). W probówkach, w których stężenie leku było mniejsze od wartości MIC obserwuje się zmętnienie (wzrost bakterii). Najniższe stężenie antybiotyku, przy którym nie rozwijają się mikroorganizmy (podłoże są przejrzyste) wyznacza wartość MIC.

·         Metoda seryjnych rozcieńczeń na podłożu stałym (z agarem)

Polega na przygotowaniu serii płytek ze stałym podłożem wzrostowym, z dodatkiem badanego antybiotyku, w malejących stężeniach. Na płytki posiewa sie bakterie z hodowli i po inkubacji obserwuje wzrost kolonii bakteryjnych. Wzrost na płytce więcej niż jednej kolonii bakteryjnej świadczy o tym, że stężenie antybiotyku w tej płytce było mniejsze od MIC. Najniższe stężenie antybiotyku, przy którym nie rozwija się więcej niż jedna kolonia, wyznacza wartość MIC.

- metoda dyfuzyjna ( E- testy) E-test (Etest, Epsilometer test) - gradientowo-dyfuzyjna metoda służąca do ustalenia najmniejszego stężenia antybiotyku hamującego wzrost drobnoustroju. Dzięki tej technice możliwe jest dokładne ustalenie stopnia oporności na dany lek i podawanie pacjentowi optymalnych dawek. Metoda ta jest stosunkowo droga i zarezerwowana wyłącznie do sytuacji, kiedy z antybiogramu wynika, że badany szczep jest oporny na wszystkie antybiotki. Metoda ta polega na nałożeniu wąskiego plastikowego paska nasączonego antybiotykiem o odpowiednim stężeniu na wysiane bakterie, inkubację w odpowiednich warunkach oraz odczytanie wyniku po około jednej dobie. W przeciwieństwie do antybiogramu badany jest MIC na wyłącznie jeden antybiotyk.

5. metody oznaczania wrażliwości drobnoustrojów na antymikotyki (rodzaj

metody, interpretacja i odczyt)

- Fungitest: umożliwia oznaczenie wrażliwości grzybów drożdżopodobnych na 6 leków p/grzybiczych: 5-fluorocytozynę (5FC), amfoterycynę B (AB), mikonazol (MCZ), ketokonazol (KET), itrakonazol (ITR), flukonazol (FLU). Test wykonuje się w studzienkach wypełnionych odwodnionymi lekami, do których podaje się zawiesinę badanego szczepu grzyba. Ocena wzrostu grzybów w studzienkach odbywa się na podstawie zmiany zabarwienia wskaźnika – kolor różowy oznacza wzrost grzyba, kolor niebieski brak wzrostu grzyba.

- ATB Fungus INT półilościowe, pozwala na oznaczanie lekowrażliwości szczepów Candida spp oraz Cryptococcus. Oznaczenie jest wykonywane w podłożu półpłynnym, w warunkach zgodnych z zalecaną metodą rozcieńczeń w bulionie

- E- testy