ENZYMY – część 1
Ogólne właściwości enzymów
Enzymy - swoiste katalizatory komórkowe przyśpieszające reakcje zachodzące w organizmie
q charakteryzują się dużą swoistością w przyspieszaniu lub nadawaniu odpowiedniego kierunku reakcjom chemicznym
q ciepłochwiejne białka proste lub złożone (wyjątek – rybozymy)
Kategorie enzymów ze względu na ich budowę chemiczną
q białka proste – amylaza, ureaza, aldolaza, RNaza
q białka złożone zawierające nieaminokwasowe grupy trwale chemicznie związane z cząsteczką enzymu (grupa prostetyczna np. hem, FAD) – oksydaza cytochromowa, katalaza, peroksydaza
q białka złożone zawierające nieaminokwasowe grupy luźno związane z cząsteczką enzymu (koenzymy np. NAD+, NADP+)) – dehydrogenazy
apoenzym + koenzym -> holoenzym (aktywny enzym)
Apoenzymy – części białkowe enzymów
Koenzymy – drobnocząsteczkowe związki organiczne lub jony nieorganiczne, których obecność w centrum aktywnym jest niezbędna do katalitycznego działania enzymu (koenzym silnie związany z cząsteczką białka = grupa prostetyczna)
Grupy prostetyczne i koenzymy (kosubstraty)
q ulegają przemianie podczas reakcji enzymatycznej
q powracają do pierwotnej postaci w wyniku reakcji wtórnej
Część białkowa – decyduje o:
q specyficzności w stosunku do substratu (jaki rodzaj substratu ulega przemianie)
q kierunku reakcji
Enzymy:
q monomeryczne – zbudowane z pojedynczego łańcucha polipeptydowego (np. lizozym, elastaza, trypsyna, heksokinaza)
- enzymy zbudowane z dwu lub więcej łańcuchów polipeptydowych połączonych mostkami S-S (np. chymotrypsyna)
q oligomeryczne – zbudowane z dwu lub więcej podjednostek połączonych ze sobą za pomocą wiązań niekowalencyjnych (np. L-asparaginaza, aldolaza)
q kompleksy wieloenzymowe (np. dehydrogenaza pirogronianowa)
Izoenzymy
q zakodowane w DNA, fizycznie odmienne postacie danego enzymu – różnią się:
- wrażliwością na temperaturę
- wrażliwością na działanie różnych związków chemicznych
- powinowactwem do substratu
- ruchliwością elektroforetyczną
- właściwościami immunologicznymi
q katalizują tę samą reakcję
q występują w różnych typach komórek lub komparmentach subkomórkowych
q dehydrogenazy, oksydazy, aminotransferazy, fosfatazy, enzymy proteolityczne
Izoformy – odmienne fizycznie postacie danego enzymu powstające w wyniku modyfikacji potranslacyjnej (np. glikozylacja, hydroksylacja, oksydacja)
Reakcje enzymatyczne
q zwiększenie szybkości reakcji 106-1011
q centrum aktywne – zgrupowanie reszt aminokwasowych, często z odległych sekwencji łańcucha polipeptydowego, z którymi łączy się substrat
q centrum allosteryczne – miejsce w obrębie cząsteczki enzymu, za którego pośrednictwem działają czynniki regulujące aktywność enzymu
Klasyfikacja i nazewnictwo enzymów
Podstawą klasyfikacji i nomenklatury enzymów jest katalizowana przez nie reakcja chemiczna.
Nazewnictwo enzymów:
q nazwa potoczna – zwykle krótkie, tworzone od nazw substratów (amylaza, arginaza, lipaza, ureaza, pepsyna, trypsyna)
q nazwa systematyczna
- identyfikuje enzym i określa jego działanie
- zgodna z zaleceniami Międzynarodowej Unii Biochemicznej z 1964 r.
q numer klasyfikacji międzynarodowej (EC)
Nazwa systematyczna - dwuczęściowa
- pierwsza część: nazwa katalizowanej reakcji + końcówka „aza” (oksydoreduktaza, transferaza, hydrolaza, liaza, izomeraza, ligaza/syntetaza)
- druga część: nazwa substratu w dopełniaczu liczby pojedynczej (np. hydrolaza acetylocholiny) lub jeżeli w reakcji uczestniczą 2 substraty podaje się nazwy obydwu substratów w mianowniku liczby pojedynczej rozdzielone dwukropkiem (np. oksydoreduktaza alkohol : NAD)
Numer międzynarodowej klasyfikacji (EC) składa się z 4 członów oddzielonych kropkami:
q człon I – oznacza numer klasy, do której należy enzym:
q człon II – oznacza podklasę
q człon III – oznacza pod-podklasę
q człon IV – oznacza kolejny numer w jego pod-podklasie
Przykład:
EC 2.6.1.1
Nazwa systematyczna:
aminotransferaza L-asparaginian : 2-oksoglutaran
Nazwa potoczna:
aminotransferaza asparaginianowa
Katalizowana reakcja:
L-asparaginian + 2-oksoglutaran <-> szczawiooctan + L-glutaminian
Oznaczanie enzymów
q pomiar ilości enzymu – po jego wyizolowaniu z badanego materiału
q pomiar aktywności enzymu – na podstawie szybkości katalizowanej reakcji uzyskujemy informację o ilości enzymu
Szybkość reakcji enzymatycznej (1)
q nie zawsze jest proporcjonalna do stężenia enzymu
q pozwala na ocenę aktywności enzymu w warunkach badania
q jest zmienna – zależy od wielu czynników chemicznych i fizycznych, mogących przyspieszać lub hamować reakcję
q maleje z czasem wskutek:
- zwiększenia szybkości reakcji w kierunku przeciwnym w miarę gromadzenia się
produktów
- hamowania aktywności enzymu przez produkt
- stopniowej inaktywacji enzymu
Szybkość reakcji enzymatycznej (2)
q odpowiednie stężenie substratu
q temperatura – stała (25, 30, 37°C)
q odpowiednio dobrany bufor - stałe, optymalne pH i siła jonowa
q aktywatory i inhibitory
Szybkość reakcji enzymatycznej (3)
q wykonujemy pomiary:
- szybkości początkowej reakcji
- szybkości w okresie, w którym pozostaje ona niezmieniona - przebiega zgodnie z kinetyką reakcji zerowego rzędu (stosujemy duże stężenia początkowe substratu)
q stała Michaelisa (KM) = stężenie substratu, przy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie prędkości maksymalnej (Vmax)
- przy stężeniu substratu równym 10∙KM szybkość reakcji stanowi 90% szybkości maksymalnej
- przy stężeniu substratu równym 0,1∙KM szybkość reakcji stanowi 9% szybkości maksymalnej
Jeżeli stężenie substratu przekracza 100∙KM
q reakcja staje się reakcją zerowego rzędu
q szybkość reakcji w dużym zakresie jest proporcjonalna do ilości enzymu
Jednostki aktywności enzymów
v konwencjonalne – ustalane przez autorów metod
v jednostka aktywności enzymatycznej (katal = kat) – jest to aktywność, która przekształca 1 mol substratów w czasie 1 sekundy (mkat, nkat, pkat)
v bezwzględna międzynarodowa jednostka standardowa enzymu (U lub IU) – jest to aktywność, która przekształca 1 mmol substratu (lub 1 mmol odpowiednich grup chemicznych) w ciągu 1 minuty, w temperaturze 30°C i w optymalnych warunkach (szczególnie pH i stężenia substratu) (U, mU, kU)
1 kat = 6∙107 U
1 U = 16,67∙10-9 kat = 16,67 nkat
v w przypadku takich substratów jak białko, wielocukier lub inna substancja, w której więcej niż jedno wiązanie ulega reakcji określenie „1 mmol substratu” zastępuje się wyrażeniem „1 mmol odpowiednich grup” – miarą szybkości reakcji jest liczba rozłożonych wiązań peptydowych czy glikozydowych, a nie liczba całkowicie zhydrolizowanych cząsteczek
v w przypadku reakcji pomiędzy dwiema identycznymi cząsteczkami za podstawę przyjmuje się nie 1 mmol, a 2 mmol (e) danej substancji
v aktywność enzymów w płynach biologicznych wyraża się w ilości jednostek standardowych na 1000 mL płynu
SPECYFICZNOŚĆ ENZYMU
v absolutna - reakcja wyłącznie z jednym substratem np. glukokinaza
v duża - możliwa reakcja z kilkoma substratami np. heksokinaza
- substraty: D-glukoza, D-fruktoza, D-mannoza,
2-deoksy-D-glukoza, D-galaktoza
- inhibitory kompetycyjne – inne heksozy, pentozy
- dwucukry i alkohole pochodne cukrów – nie hamują i nie reagują
v mała - np. esterazy – hydrolizują estry organiczne do alkoholi i kwasów karboksylowych
v grupowa – np. fosfatazy – odczepiają grupę fosforanową z większości organicznych estrów fosforanowych (z różną prędkością)
v stereoizomeryczna – enzymy rozpoznają tylko jeden z możliwych stereoizomerów (np. D-cukry, L-aminokwasy)
WARUNKI REAKCJI ENZYMATYCZNEJ (1)
1. STĘŻENIE SUBSTRATU
Kinetyka reakcji enzymatycznej z jednym substratem
v Krzywa Michaelisa-Menten
v Wykres Lineweavera-Burka
Kinetyka reakcji enzymatycznej z dwoma substratami
Mechanizmy:
1) sekwencyjne
v substraty biorące udział w reakcji muszą być związane z enzymem przed uwolnieniem pierwszego produktu
v mogą być:
- uporządkowane – przyłączanie substratów i
odłączanie produktów odbywa się w ściśle
określonej kolejności
- losowe
2) ping-pong - jeden lub więcej produktów jest uwalnianych przed przyłączeniem wszystkich substratów
v Mechanizm sekwencyjny uporządkowany reakcji typu dwa-dwa (bi-bi)
Przykład: LDH
v Mechanizm ping-pong w reakcji typu dwa-dwa
Przykład: AST, ALT
Stała Michaelisa
v 10-5-10-3 mol/l
v Vmax dla reakcji 1- i 2-substratowych przy 100∙KM
(dla 3-substratowych 1000∙KM) – ograniczenia:...
xyzgeo