1.3 Odkażanie.pdf

1.2 Pożywki

1.3 Odkażanie

W typowych kulturach in vitro panują warunki możliwie dokładnie kontrolowane. Hodowane

rośliny wolne są od zakażeń, albo towarzyszy im tylko ściśle określony i celowo wprowadzony

przez badacza rodzaj drobnoustrojów. Takie czyste, wolne od przypadkowych zakażeń kultury

nazywamy aksenicznymi. Kultury in vitro powinny być akseniczne. Wymaga to odkażenia zarówno

pożywki jak i materiału roślinnego używanego do założenia hodowli. Odkażaniu trzeba też poddać

wszelkie narzędzia i naczynia z którymi eksplantaty mogą się stykać.

Najczęściej stosowaną metodą odkażania pożywek i wszelkiego rodzaju płynów (np. wody do

płukania materiału roślinnego), a czasami także naczyń i narzędzi jest autoklawowanie. Zabieg ten

polega na przetrzymywaniu materiału w parze wodnej o wysokiej temperaturze (zwykle ok. 120°C)

i wysokim ciśnieniu (zwykle 1 atm, tj. 0,1 MPa, powyżej ciśnienia atmosferycznego). W wodnych

roztworach przy podanym ciśnieniu zachodzi wrzenie w temperaturze 121°C, a więc jest to

maksymalna temperatura do jakiej można doprowadzić te roztwory przy podanym ciśnieniu

(oczywiście, w warunkach ciśnienia atmosferycznego nie dało by się ich podgrzać powyżej 100°C).

Przyjmuje się, że w podanych warunkach w ciągu około 15 minut w autoklawowanym roztworze

giną wszelkie drobnoustroje. Jednakże mija trochę czasu zanim cała objętość roztworu osiągnie

zadaną temperaturę, stąd w praktyce czas autoklawowania wydłuża się, zależnie od objętości

roztworu, do 20 - 30 minut (przy typowych objętościach, nie przekraczających 1 litra). Nie

wszystkie substancje dają się podgrzać do 121°C - niektóre są zbyt nietrwałe i ulegają w takich

warunkach rozkładowi. Jeśli pożywka zawiera takie wrażliwe składniki (zwane też termolabilnymi)

to można odkazić je w niewielkiej objętości roztworu na zasadzie filtracji, a potem dodać do

wyautoklawowanej i ochłodzonej pożywki. Stosuje się w tym celu filtry o porowatości poniżej 0,3

μm (zwykle 0,22 μm), które powinny zatrzymać wszelkie zarodniki grzybów i przetrwalniki

bakterii. Same filtry, przed ich wykorzystaniem mogą być poddane autoklawowaniu, albo

dostarczane są przez producenta gotowe do użycia, odkażone promieniami X lub gamma

(promienie X, to promieniowanie elektromagnetyczne o długości fali 10 -11 - 10 -9 m, natomiast

promienie γ to fale elektromagnetyczne o długości poniżej 10 -11 m). Typowymi związkami

termowrażliwymi, wymagającymi odkażania przez filtrację, są np. GA 3 , zeatyna, ABA, mocznik,

niektóre witaminy. W pewnym stopniu termolabilna jest też sacharoza, która w wysokiej

temperaturze częściowo rozpada się na fruktozę i glukozę. Podczas długotrwałego autoklawowania

może dochodzić także do karmelizacji - powstają brunatne aldehydy, takie jak furfural,

metylofurfural, metyloglioksal. Działają one niekorzystnie na wzrost tkanek, dlatego niektórzy

autorzy zalecają żeby roztwory sacharozy odkażać przez filtrację (choć w praktyce, przy typowej,

niezbyt wysokiej zawartości sacharozy w pożywce, bardzo rzadko się tego przestrzega).

Metalowe narzędzia, takie jak skalpele pincety, igły preparacyjne mogą być odkażane przez

autoklawowanie, albo w roztworze podchlorynu sodu (podobnie jak materiał biologiczny - patrz

niżej), najczęściej jednak odkaża się je przez zanurzenie w alkoholu (denaturacie), a następnie

opalenie nad palnikiem gazowym albo w specjalnym elektrycznym sterylizatorze. W odniesieniu do

termoodpornych pustych naczyń i narzędzi można też zastosować tzw. suchą sterylizację,

polegającą na przetrzymaniu ich w wysokiej temperaturze w suchym powietrzu (co najmniej 3

godz. w 160°C, albo 2 godz. w 170°C, albo pół godz. w 180°C).

Do powierzchniowego odkażania materiału biologicznego (części roślin) wykorzystuje się

substancje uwalniające chlor (podchloryn sodowy, podchloryn wapnia, chloraminę) lub tlen (wodę

utlenioną), a znacznie rzadziej stosowane są: woda bromowa, chlorek rtęci, antybiotyki i in. Przed

zamoczeniem fragmentów roślin w roztworze czynnika odkażającego wskazane jest umycie

materiału pod bieżącą wodą, a w przypadku organów podziemnych, nawet ich kilkugodzinne

płukanie. Należy także wyciąć ewentualne tkanki zamierające, dobierając do odkażania materiał

możliwie najzdrowszy. Często odkażanie powierzchniowe zaczyna się od krótkiego

(kilkudziesięciosekundowego) moczenia materiału w stężonym alkoholu etylowym (70% lub

absolutnym). Ten wstępny etap może unieszkodliwić niektóre drobnoustroje, dodatkowo natomiast

ma za zadanie usunąć, z powierzchni roślinnej tkanki, woski, tłuszcze i wszelkie inne hydrofobowe

substancje, które mogłyby utrudnić dostęp właściwego czynnika odkażającego. Dla ułatwienia

kontaktu roztworu odkażającego z powierzchnią komórek czy tkanek, do roztworu tego dodaje się

też często niewielką ilość dowolnego detergentu (środka obniżającego napięcie powierzchniowe

roztworu). Należy pamiętać, że z reguły czynnik odkażający działa w pewnym stopniu szkodliwie

nie tylko na drobnoustroje, ale i komórki roślinne. Czas działania czynnika odkażającego i jego

stężenie trzeba dobrać doświadczalnie, zależnie od gatunku rośliny i rodzaju tkanki (typowe

wartości podano w tabeli 5). Niektóre substancje przeciwdrobnoustrojowe mogą być ponadto

dodawane do pożywki i w ten sposób przez cały czas chronią kulturę przed zakażeniem. Są to

przede wszystkim antybiotyki (nieskuteczne w odniesieniu do grzybów) oraz preparat inhibitora

oddechowego pod handlową nazwą PPM ( Plant Preservative Mixture ), zwalczający zarówno

bakterie jak i grzyby. Po odkażaniu powierzchniowym materiał kilkakrotnie płucze się jałową wodą

destylowaną, po czym można przystąpić do wycinania właściwych eksplantatów pierwotnych i

układania ich na pożywce.

W celu uniknięcia zakażeń drobnoustrojami unoszącymi się w powietrzu wszystkie manipulacje na

jałowych materiałach, takie jak przelewanie pożywki, odkażanie materiału biologicznego,

wycinanie eksplantatów, czy przeszczepianie hodowli, wykonywane są w tzw. komorze laminarnej

(dokładniej - komorze z laminarnym nawiewem powietrza). Komora podczas pracy przemywana

jest stale laminarnym (tj. niezaburzonym, równomiernym) strumieniem jałowego powietrza, co

uniemożliwia wtargnięcie do jej wnętrza drobnych zanieczyszczeń unoszących się w powietrzu.

Powietrze przepływające przez komorę jest jałowe, ponieważ przechodzi przez tzw. filtr absolutny

czyli HEPA (ang. high efficiency particulate air filter ) tj. filtr o porowatości 0,22 μm. Przepływ

powietrza wymuszony jest przez elektryczny wentylator. Powietrze zasysane spoza komory

przechodzi najpierw przez filtr wstępnego oczyszczania, po czym tłoczone jest przez filtr absolutny

(stanowiący tylną lub górną ściankę wnętrza komory). Przed rozpoczęciem pracy w komorze jej

wnętrze odkażane jest przez 20 - 30 minutowe naświetlanie promieniami nadfioletowymi (UV-C, o

długości fali około 265 nm), a jednocześnie uruchamiany jest przepływ powietrza, dzięki czemu

niektóre mikrozanieczyszczenia zostają po prostu z komory wydmuchane. Później blat komory

odkażany jest przez przetarcie 50% alkoholem izopropylowym (albo 70% etanolem). Osoba

rozpoczynająca pracę przy komorze laminarnej odkaża również ręce przez przetarcie ich

alkoholem. Komora laminarna w znacznym stopniu pozwala na uniknięcie przypadkowych

zakażeń, ale praca przy niej wymaga staranności i uwagi. Trzeba pamiętać, że główną barierą dla

drobnoustrojów jest słabo wyczuwalny strumień powietrza; łatwo naruszyć tę osłonę wykonując

szybkie, gwałtowne ruchy rąk, rozmawiając (zwłaszcza ustami zwróconymi do wnętrza komory),

kichając, wkładając głowę do wnętrza komory, ustawiając w poprzek komory wysokie naczynia

utrudniające przepływ powietrza. Znakomitym sposobem na "uzyskanie" zakażeń, pomimo

stosowania komory laminarnej, jest też przenoszenie rąk nad jałowymi (w założeniach) naczyniami

i narzędziami. Pomimo odkażania rąk alkoholem, na ich powierzchni pozostaje sporo

drobnoustrojów, które opadając mogą zakażać materiały i narzędzia. Dlatego zanim sięgniemy do

wnętrza komory po znajdujące się tam przedmioty, musimy zakryć albo wsunąć w głąb komory

wszystkie naczynia i materiały, tak by uniknąć ich zakażania. Przedmiotów jałowych nie dotykamy

nigdy palcami, ale wykorzystujemy wysterylizowane szczypczyki (pincety). Co kilka do kilkunastu

minut powtarzamy sterylizację metalowych narzędzi.

Tabela 4. Skład wybranych pożywek do roślinnych hodowli in vitro

czynnik

odkażający

czas

odkażania

(min)

uwagi

stężenie

(%)

podchloryn

sodu

0,5 - 2 5 - 30

bardzo skuteczny; tworzy zupełnie klarowny roztwór;

jego łatwo dostępnym źródłem może być chlorowy

wybielacz do bielizny (np. płyn Ače - odpowiednio

rozcieńczony!); występujące w nim dodatki zapachowe

w żaden sposób nie szkodzą; dla zwiększenia trwałości

tego roztworu jest on jednak silnie zalkalizowany;

niektórzy badacze zalecają zobojętnienie go kwasem

solnym przed użyciem do odkażania (nie wydaje się to

jednak konieczne)

podchloryn

wapnia

9 - 10 5 - 30

bardzo skuteczny, ale trudno rozpuszczalny w wodzie

tworzy "mleczko"

chloramina T 5

do 30

skuteczna; rozpuszczalna w wodzie, trwalsza niż

podchloryny

nadtlenek

wodoru

10 - 12 5 - 15

skuteczny; często stosowany do odkażania nasion roślin

iglastych

woda

bromowa

1 - 2 2 - 10

skuteczna

azotan srebra 1

5 - 30

dość skuteczne, ale zużyte roztwory są bardzo uciążliwe

dla środowiska, dlatego stanowczo nie zalecane

chlorek rtęci 0,1 - 1 2 - 10

antybiotyki 4 - 50

mg/l

30 - 60 bardzo skuteczne w zwalczaniu bakterii; zupełnie

nieskuteczne w zwalczaniu większości grzybów

1.4 Fizyczne warunki hodowli

Ostatnia aktualizacja: 11.01.2008

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: