Podstawy diagnostyki wirusologicznej.
Objawy kliniczne + badanie wirusologiczne które ma na celu:
· Izolacja i identyfikacja wirusa
· Wykazanie 4krotnego wzrostu miana przeciwciał
· Wykazanie zmian w płynach ustrojowych chorego
Badanie wirusologiczne etapy:
1) Pobranie, transport i przechowywanie materiału diagnostycznego
2) Opracowanie materiału i zakażenie nim hodowli
3) Prowadzenie hodowli i wykazanie w niej obecności wirusa
4) Izolacja wirusa, określanie miana i identyfikacja
5) Oznaczenie miana przeciwciał w surowicy chorego
Ad 1:
-materiał pobierany dzieli się na płynny, półpłynny i stały
-pobiera się go jałowo
-materiał z którego później izoluje się wirusy pobiera się w pierwszych dniach choroby, z miejsc gdzie jest największe prawdopodobieństwo znalezienia wirusów.
-krew do oznaczania miana przeciwciał pobiera się 2 razy: na początku choroby i w czasie rekonwalescencji
-materiał musi być dostarczony jak najszybciej do laboratorium w naczyniu z lodem najlepiej w silnym zamrożeniu -25◦C
-środków chemicznych do konserwacji raczej się nie stosuje
-krwi do badań serologicznych nie zamraża się
Ad 2:
Materiał płynny
1)Dodać antybiotyk (penicylina, streptomycyna, nystatyna, tetracyklina)
2)Do lodówki na 1h
3)Odmrozić
4)Wirować
5)Zarażać hodowle
Materiał papkowaty (kał)
1)Dodać antybiotyk w płynie PBS
2)Do naczynia wrzucić kulki szklane i wstrząsa się na trzęsawce przez 1 h
3)Zamrozić zawiesinę -25◦C na 1h
4)Odmrozić
5)Wirować
6)Zakładać hodowle
Materiał stały (sekcyjny)
1)Dodać płynu z antybiotykami i średnioziarnistego piasku
2)Rozcierać
3)Odciągnąć płyn
4)Zamrozić
5)Odmrozić
6)Wirować
7)Zakażać hodowle
Zakażanie hodowli w Ad 3
Ad 3:
Hodowla
Wirusy musza być hodowane w żywych układach, obecnie stosuje się głównie hodowle komórkowe można tez stosować zarodki kurze i zwierzęta.
Rodzaje hodowli komórkowych:
-Pierwotna
Jednorazowa, np.: hodowla fibroblastów kurzych lub nerki małpy
-Ciągła (heteroploidalna)
Przygotowane z „unieśmiertelnionych” linii komórkowych dlatego mogą być pasażowane nieskończenie długo.
-Półciągłe (diploidalne)
Mogą być pasażowane 20-30 razy
Zakładanie hodowli komórkowych:
Polega na tym że hoduje się komórki uwolnione z tkanki przez zadziałanie trypsyną która rozpuszcza lepiszcze wiążące ze sobą komórki, potem się trypsynę odwirowywuje i dolewa płynu odżywczego. Są dwie metody takiej hodowli:
-hodowla komórek zawieszonych w płynie
-hodowla jednowarstwowa (tworzy się jedna warstwa komórek na szkle patrz hodowla fibroblastów kurzych skrypt str 111)
Płyny odżywcze w hodowlach komórkowych:
-podtrzymujące (2-5% surowicy)
-wzrostowe (5-20% surowicy)
Różnią się tylko zawartością surowicy a pozatym każdy z nich zawiera:
-Płyn podstawowy: aminokwasy, cukry, prekursory kw. Nukleinowych, sole mineralne, bufory, witaminy, barwniki
-Antybiotyki
-hydrolizat laktoalbuminy: bogate źródło subst. Odżywczych
-surowica: różnicuje płyny na podtrzymujące i wzrostowe, hamuje działanie trypsyny i stanowi środowisko do wymiany substancji
-sole wapnia: gdy komórki musza być przyklejone do szkła
Zakażanie hodowli:
1)Odciągnąć płyn wzrostowy (??)
2)Przepłukać hodowlę PBS
3)Nanieść badana zawiesinę na komórki
4)Pozostawić na kilka godzin
5)Odciągnąć zawiesinę
6)Przepłukać PBS i dodać płyn podtrzymujący
7)Zamknąć hodowle korkiem i do cieplarki
Pasażowanie hodowli komórkowych:
Przeniesienie komórek z jednego naczynia hodowlanego do drugiego. Zlewa się płyn odżywczy, dodaje trypsyne żeby rozbiła hodowlę dodaje nowego płynu odżywczego i rozlewa.
Wykrywanie wirusa w hodowli:
Obecność namnażających się wirusów można stwierdzić następującymi metodami:
-mikroskop elektronowy (ogładanie wirusów)
-mikroskop świetlny (obserwacja efektu cytopatycznego)
-metoda łysinkowa (dodaje się do hodowli agarozy lub metylocelulozy która hamuje rozprzestrzenianie się wirusów, potem dodaje się czerwieni obojętnej która barwi tylko komórki żywe – czyli tylko te które nie są zakażone wirusami.
-odczyn hemaglutynacji (wirusy które posiadają hemaglutyninę aglutynują dodana zawiesinę krwinek)
-odczyn hemadsorbcji (niektóre wirusy wbudowywują hemaglutynine w błonę komórkową zakażonej komórki, dodaje się krwinek i obserwuje się przyleganie krwinek do komórek)
-próba barwna Salka (zmiana barwy płynu odżywczego gdy są wirusy)
-metoda interferencji (gdy szukany wirus nie wywołuje efektu cytopatycznego, nadważa się hodowle wirusem ECHO który wytwarza efekt cytopatyczny – jeśli jest obceny szukany wirus to będzie on hamował ECHO i efektu nie będzie – np. szukanie wirusa różyczki)
-metody immunologiczne – szukanie wolnych antygenów wirusowych
Ad 4:
Izolacja:
1)Mechaniczne rozbicie komórek przez rozcieranie żeby uwolnić wirusy z komórek
2)Wirowanie
3)Oczyszczanie – metody:
· Metoda wysalania
· Przesączanie przez filtry
· Wirowanie tonalne
· Techniki adsorpcyjne
· Chromatografia
· Hemaglutynacja (adsorpcja wirusa do krwinki czerw.)
· Surowica odpornościowa (najlepsze oczyszczenie)
Miareczkowanie
Określanie miano czyli ilość zakaźnych cząstek wirusa w 1ml zawiesiny tkanek zwierzęcia lub płynu komórkowego. Robi się szereg rozcieńczeń a potem szczepi się nimi zwierzęta i patrzy się co się z nimi stanie – na podstawie obserwacji stwierdza się dawkę efektywną ED50 czyli najmniejszą ilość czynnika działającego który wywołuje reakcję u 50% obiektów doświadczalnych.
Identyfikacja:
Etapy:
1)izolacja
2)określanie na podstawie właściwości:
· Wielkości
· Typu kw. Nukleinowego
· Wrażliwość na eter
· Wrażliwość na pH=3
· Inaktywacyjne działanie ciepła w obecności kationów
· Wrażliwość na trypsynę
· Obecność kwasu neuraminowego
3)identyfikacja serologiczna:
· Zahamowanie hemaglutynacji – wykazanie obecności przeciwciał wytworzonych przez org pacjenta przeciw hemaglutyninom np. wirusa grypy (takie przeciwciało hamuje aglutynacje wywoływaną przez wirus)
· Odczyn wiązania dopełniacza – wykrycie przeciwciał wiążących dopełniacz czyli IgG i IgM (ale nie odróżnia G od M)
· Odczyn immunofluorescencji bezpośredniej – do materiału dodaje się oznaczone fluoresceiną przeciwciało i bada się czy się przyczepiły do wirusa
· Odczyn immunoenzymatyczny EIA – szybkie wykrywanie antygenów
4)Inne:
Hybrydyzacja DNA – wykrywanie genomu wirusowego za pomocą hybrydyzowania wirusowego DNA z nicią komplementarna, skuteczność zwiększa się użyciem PCR.
4
dworzu 2005/2006
bombelspec