ELISA (ang. Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) czyli test immunoenzymatyczny lub immunoenzymosorbcyjnyJest jednym z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych. Służy on do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych skoniugowanych z odpowiednim enzymem.
•Zasada działania testu ELISA polega na tym, że przeciwciało związane z określonym enzymem może specyficznie rozpoznawać dane białko (zawarte w materiale biologicznym), które wcześniej zostało unieruchomione na podłożu. Po dodaniu przeciwciał następuje utworzenie kompleksów immunologicznych, zatem przeciwciało także zostaje unieruchomione. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała i dodaniu substratu dla enzymu związanego z przeciwciałem zajdzie reakcja enzymatyczna, czemu z kolei będzie towarzyszyło pojawienie się produktu. Wykrycie jego obecności (może to być np. produkt barwny powstający z bezbarwnego substratu) świadczy o obecności danego białka w badanym materiale. Mierząc z kolei ilość powstającego produktu można także przeprowadzić analizę ilościową.
•Każdy test immunoenzymatyczny wymaga opłaszczenia fazy stałej przeciwciałem lub antygenem.
•
•Jako fazy stałej używa się zwykle płytek polistyrenowych lub pleksiglasowych ze studzienkami (dołkami), do których można dodawać niewielkie ilości roztworów.
•Każda studzienka pełni więc funkcję mikroprobówki, przy czym w testach ELISA używa się zwykle płytek 96-dołkowych.
•Oprócz płytek plastikowych możliwe jest także używanie innych materiałów, np. różnego rodzaju błon o ustalonym składzie chemicznym czy też granulek materiału magnetycznego.
Enzymy używane jako znaczniki:
· peroksydaza chrzanowa (HRP)
· fosfataza alkaliczna (AP)
· b-D-galaktozydaza
· Oksydaza glukozowa
Najczęściej stosowane chromogeny:
· 3,3’-diaminobenzydyna (DAB)
· o-fenylenodiamina (OPD)
· tetrametylobenzydyna (TMB)
· 3-amino-9-etylokarbazol (AEC)
Najczęściej stosowane odmiany testu ELISA
1.Test kanapkowy ("Sandwich" ELISA - test podwójnego wiązania ):
- bezpośredni
- pośredni
2. Testy kompetycyjne (konkurencyjne)
Antygen po związaniu przez przeciwciała umieszczone na płytce zostaje wykryty przez kolejne przeciwciało, które związano ze znacznikiem (enzymem)
Metoda kanapkowa
1)Bezpośrednia
2)Pośrednia
Metoda Pośrednia
Przeciwciało monoklonalne rozpoznające swoiście antygen nie jest znakowane (ang. primary antibody). Zankowane jest natomiast kolejne przeciwciało, rozpoznające dany izotyp immunoglobulin. Mówiąc inaczej, dysponujemy dodatkowym przeciwciałem (drugim przeciwciałem - ang. secondary antibody), rozpoznającym klasę przeciwciała pierwotnego. Jeżeli zatem do wykrycia antygenu używamy swoistego przeciwciała klasy IgG, to drugie przeciwciało musi rozpoznawać właśnie przeciwciała klasy IgG, niezależnie od tego, jaką wykazują one specyficzność.
Zaletą tej metody jest to, że nie trzeba znakować specyficznych względem antygenu przeciwciał. Pozwala to na użycie różnych przeciwciał pierwotnych, bez potrzeby dodatkowych manipulacji związanych z ich znakowaniem, po czym przeciwciała te mogą zostać wykryte za pomocą zawsze takich samych przeciwciał znakowanych
Test ELISA (sandwich)
przeciwciało związane z fazą stałą
+
badany antygen
przeciwciało związane z enzymem
chromogen
=
reakcja barwna
Ten rodzaj testu immunoenzymatycznego służy zwykle do określania stężenia danego białka (antygenu) w badanej próbce. Nazwa tej metody, sandwich ELISA, czyli "kanapkowa" ELISA bierze się stąd, że antygen wiązany jest pomiędzy dwiema "warstwami" przeciwciał
Etapy metody kanapkowej
Pierwszym krokiem jest umieszczenie specyficznego względem danego antygenu przeciwciała na fazie stałej, np. płytce (1, 2). Po wypłukaniu przeciwciał, które nie związały się z płytką, można dodać badany materiał (3). Po dodaniu badanego materiału płytkę znowu się przepłukuje. Teoretycznie więc na płytce powinny pozostać jedynie przeciwciała, a jeżeli badany antygen był obecny - do niektórych przynajmniej przeciwciał powinien być przyłączony antygen (4).
Antygen jest już wyodrębniony z mieszaniny, dzięki użyciu specyficznego przeciwciała, jednak osoba przeprowadzająca badanie nie jest jeszcze w stanie stwierdzić, czy tak się rzeczywiście stało. W tym celu dodawane jest kolejne przeciwciało, tym razem wyznakowane enzymem (5).
Przeciwciało to również jest specyficzne względem poszukiwanego antygenu, jednak rozpoznaje inny region cząsteczki białkowej - dzięki temu przeciwciało użyte do wychwycenia antygenu nie blokuje przeciwciała znakowanego enzymem. Po przepłukaniu uzyskujemy strukturę "kanapki" (sandwicha), antygen znajduje się pomiędzy dwiema warstwami przeciwciał (6). Teraz można dodać już substrat dla enzymu związanego z przeciwciałem (7). W wyniku reakcji enzymatycznej powstaje barwny produkt (8).
Test ELISA
antygen związany z fazą stałą
badane przeciwciało
przeciwciało antyglobulinowe związane z enzymem
Metody immunocytochemiczne
•Immunochemia – gałąź immunologii wykorzystująca reakcje chemiczne i reakcje immunologiczne, badająca strukturę i swoistość antygenów i przeciwciał oraz interakcji między nimi.
•Immunohistochemia/immunocytochemia – badanie tkanek i komórek wykorzystujące reakcje immunochemiczne. Jest to metoda wykrywania rozmaitych substancji antygenowych w skrawkach mikroskopowych, stosowana w histopatologii i histologii. Polega na zastosowaniu przeciwciała skierowanego przeciwko poszukiwanym składnikom preparatu a następnie systemu detekcji, tworzącego barwną, nierozpuszczalną substancję, widoczną w mikroskopie
Metody immunocytochemiczne - polegają na wykrywaniu i lokalizacji składników komórek i tkanek na zasadzie reakcji antygen-przeciwciało. Najczęściej wykrywamy antygen za pomocą swoistych przeciwciał. Rzadziej stosowaną odmianą reakcji immunocytochemicznej jest tzw. reakcja odwrócona, polegająca na wykrywaniu przeciwciał w tkance za pomocą znakowanego antygenu.
Przeciwciała używane w immunohistochemii.
Głównie immunoglobuliny klasy IgG i IgM.
Mogą być stosowane przeciwciała:
poliklonalne – zawierające mieszaninę przeciwciał przeciwko różnym determinantom antygenowym tego samego antygenu
monoklonalne – skierowane przeciwko jednej, ściśle określonej determinancie antygenowej. Wykazują monoswoistość. Wszystkie drobiny przeciwciała wykazują takie samo powinowactwo do antygenu.
Determinanta antygenowa (epitop) – najmniejsza jednostka antygenu, którą może rozpoznać przeciwciało
•Wprowadzono nowe techniki pozwalające podnieść czułość i swoistość metod. Zaliczamy do nich metody pośrednie, metody z nieznakowanymi przeciwciałami (metoda PAP), metody w układzie awidyna-biotyna (metoda ABC), znakowanie digoksygeniną oraz metodę białko A-złoto koloidalne.
•Dalszym postępem w immunocytochemii było wprowadzenie metod służących do wykrywania kilku antygenów na tych samych skrawkach.
•Ostatnio wprowadzono wyjątkowo czułą metodę ImmunoMax, która pozwala wykrywać minimalne ilości antygenu, gdyż jest ona kilkaset razy bardziej czuła niż klasyczna metoda ABC.
Znaczniki stosowane w metodach immunocytochemicznych:
· Fluorochromy
· Enzymy
· Białka zawierające metal ciężki
· Metale ciężkie
· Pierwiastki promieniotwórcze
Chromogeny (substraty) używane w immunohistochemii
· Dla peroksydazy chrzanowej:
o 3,3’-diaminobenzydyna (DAB)
o 3-amino-9-etylokarbazol (AEC)
o 4-chloro-1-naftol (CN)
o p-fenylodiamino dihydrochlorek (pirokatechol, odczynnik.Hanker’a-Yates’a)
· Dla fosfatazy alkalicznej
o AS-MX fosforan naftolu
o nowa fuksyna
1.Metody bezpośrednie
2.Metody wielostopniowe
a)Metody pośrednie
b)Metody nieznakowanych przeciwciał:
•Mostek pojdynczy
•Mostek podwójny
•Metoda PAP i jej odmiany
c)Inne:
•Metody z białkiem A
•Układ awidyna – biotyna (metoda ABC)
•Metody znakowanych antygenów
3.Metody wykrywania kilku antygenów
1) metoda bezpośrednia
Jest to najprostszy i najmniej czasochłonny wariant reakcji. Badany materiał inkubuje się wyłącznie z jednym, znakowanym przeciwciałem.
Metoda wymaga znakowanego przeciwciała skierowanego przeciw wykrywanemu antygenowi
Metoda bezpośrednia wykorzystywana jest przede wszystkim do wykrywania immunoglobulin, dopełniacza i kompleksów immunologicznych
2) metoda pośrednia (two steps)
Jest to procedura dwuetapowa:
-najpierw inkubuje się badaną tkankę ze swoistym przeciwciałem,
-a następnie związane już z antygenem tkankowym przeciwciało lokalizuje się drugim, znakowanym przeciwciałem (antyglobuliną) skierowanym przeciwko immunoglobulinom zwierzęcia od którego uzyskano pierwsze przeciwciało
...
ludi.lg