ĆWICZENIE 1 – 01.03.2011
Hemoglobina, produkty przemiany hemoglobiny metabolizm żelaza
ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1. Transport O2 i CO2 przez hemoglobinę (Hb).
2. Katabolizm hemu, bilirubina wolna i związana.
3. Białka transportujące i magazynujące jony żelaza.
4. Metody wykorzystywane do oznaczania bilirubiny, Hb i żelaza.
WPROWADZENIE
Hemoglobina
Hemoglobina jest hemoproteiną zbudowaną z czterech łańcuchów polipeptydowych, a każdy łańcuch połączony jest z cząsteczką hemu. Bierze ona udział w transporcie tlenu z płuc do tkanek i w pewnym stopniu także CO2 z tkanek do płuc. W naczyniach włosowatych pęcherzyków płucnych, do jonów Fe2+ znajdujących się w grupie hemowej cząsteczki hemoglobiny, przyłączają się cztery cząsteczki tlenu (1 g Hb wiąże 1,36 cm3 tlenu); powstaje oksyhemoglobina - hemoglobina utlenowana. W krwi żylnej tlen odłącza się i dyfunduje do komórek różnych tkanek.
Do wolnych grup aminowych w części białkowej cząsteczki Hb może przyłączyć się CO2, powstają karbaminiany hemoglobiny. W tej postaci transportowane jest około 20% CO2.
Prawidłowa zawartość Hb w 100 cm3 krwi pełnej wynosi u mężczyzn 14-18 g, u kobiet 12-16g, a u noworodków 18-27 g.
Bilirubina
Rozpad erytrocytów zachodzi w komórkach układu siateczkowo-śródbłonkowego, głównie wątroby, śledziony i szpiku kostnego. Tam też następuje przemiana hemu w bilirubinę. W pierwszym etapie tego procesu bierze udział zlokalizowana w mikrosomach oksygenaza hemowa, związana z mikrosomalnym łańcuchem transportu elektronów. Przy udziale O2 i NADPH+H+ prowadzi ona hydroksylację węgla w grupie metinowej znajdującej się między dwoma pierścieniami pirolowymi i następnie jego usunięcie w postaci CO. W wyniku tego następuje rozerwanie układu porfirynowego i powstaje niebieskozielony barwnik - biliwerdyna, posiadająca czteropirolowy układ łańcuchowy. Następnie biliwerdyna redukuje się pod wpływem reduktazy biliwerdyny i powstaje pomarańczowożółta bilirubina, która dyfunduje do krwi.
Reakcja katalizowana przez reduktazę biliwerdyny:
biliwerdyna + NADPH + H+ → bilirubina + NADP+
Bilirubina jest związkiem trudnorozpuszczalnym, transportowanym do wątroby w połączeniu z albuminami. Jedna cząsteczka albuminy łączy się z dwiema cząsteczkami bilirubiny. Jest to tzw. bilirubina wolna, nazywana także bilirubiną pośrednią lub przedwątrobową. W warunkach fizjologicznych jej stężenie waha się w granicach 0,1-1,0 mg/100 cm3. W warunkach prawidłowych w osoczu występuje tylko bilirubina wolna. Jest ona wychwytywana przez komórki wątroby, zostaje odłączona od albuminy i przeniesiona do wnętrza hepatocytu.
W wątrobie słabo polarna cząsteczka bilirubiny ulega dalszym przemianom, które zwiększają jej rozpuszczalność i umożliwiają sekrecję do żółci.
1) 75% bilirubiny wchodzi w reakcję z UDP-glukuronianem i powstają diglukuronidy bilirubiny (kwas glukuronowy tworzy wiązanie estrowe z grupą karboksylową bilirubiny). Reakcja katalizowana jest przez UDP-glukuronozylotransferazę bilirubiny:
bilirubina + 2 UDP-glukuronian → diglukuronid bilirubiny + 2 UDP
2) 15% bilirubiny wchodzi w reakcję z aktywnym siarczanem (5` fosfosiarczanem 3` fosfoadenozyny), przy udziale sulfotransferazy ulega ona estryfikacji i tworzą się siarczany bilirubiny.
3) 10% bilirubiny tworzy połączenia z glicyną, tauryną i metioniną.
Powstające pochodne bilirubiny tworzą tzw. bilirubinę związaną, nazywaną także bilirubiną bezpośrednią lub wątrobową. W tej postaci bilirubina aktywnie wydzielana jest do żółci i wraz z nią przechodzi do przewodu pokarmowego, gdzie ulega dalszym przemianom pod wpływem flory bakteryjnej. W warunkach prawidłowych bilirubina związana nie występuje w osoczu. Dla odróżnienia obu postaci bilirubiny (tzn. wolnej i związanej) wykonuje się odczyn van den Bergha. Dodatni wynik tej próby wskazuje na obecność we krwi bilirubiny związanej.
Stężenie bilirubiny w osoczu przekraczające 1 mg/100 cm3 oznacza bilirubinemię. Umiarkowany wzrost stężenia bilirubiny nie zawsze jest zjawiskiem patologicznym. U 5-7% populacji stwierdza się nieznaczną bilirubinemię bez towarzyszących zmian patologicznych.
Hiperbilirubinemia może być spowodowana upośledzeniem sprzęgania bilirubiny w wątrobie lub zaczopowaniem przewodów żółciowych, a także wytwarzaniem większej ilości bilirubiny niż jest w stanie wydzielić do przewodów żółciowych prawidłowo funkcjonująca wątroba. Przy stężeniu bilirubiny w osoczu przekraczającym 2-2,5 mg/100 cm3 dyfunduje ona do tkanek dając obraz kliniczny określany mianem żółtaczki. Oznaczanie stężenia bilirubiny w osoczu (pośredniej i bezpośredniej) ma duże znaczenie w diagnozowaniu żółtaczek. Wzrost stężenia bilirubiny przedwątrobowej (pośredniej) towarzyszy żółtaczce noworodków. Przyczyną tego stanu jest nadmierna hemoliza erytrocytów oraz niezdolność wątroby do skutecznego sprzęgania i wydzielania zwiększonej ilości bilirubiny. Stan taki uznaje się za fizjologiczny. Jednak, gdy stężenie bilirubiny wolnej u noworodków wzrośnie powyżej 20 mg/100 cm3 może ona przekraczać barierę krew-mózg. Następstwem tego stanu jest kernicterus – żółtaczka jąder podstawnych mózgu, prowadząca do upośledzenia umysłowego.
Przyczyną podwyższonego stężenia bilirubiny przedwątrobowej może być też niedokrwistość hemolityczna, a także dziedziczne zaburzenia sprzęgania bilirubiny w wątrobie spowodowane brakiem lub poważnymi niedoborami UDP-glukuronozylotransferazy bilirubiny (zespół Criglera-Najjara, typ I, typ II). Umiarkowanie podwyższone stężenie bilirubiny wolnej (1,2-3,0 mg/100 cm3) występuje też u osób dotkniętych zespołem Gilberta, obejmującym 3-10% populacji. Spowodowane jest to upośledzeniem wychwytu bilirubiny przez wątrobę lub znacznie częściej niedoborem UDP-glukuronozylotransferazy bilirubiny. Obecność dwu dodatkowych nukleotydów (TA) w regionie promotora genu tego enzymu powoduje jego obniżoną ekspresję.
Podwyższony poziom bilirubiny wolnej może być też spowodowany uszkodzeniem miąższu wątroby, powstałym w następstwie: wirusowego zapalenia wątroby, marskości wątroby, zatruć (chlorowcopochodnymi węglowodorów, α-amanityną), długotrwałego przyjmowania hepatotoksycznych leków. Takim stanom na ogół towarzyszy upośledzenie wydzielania sprzężonej bilirubiny, prowadzące do wzrostu jej stężenia w osoczu.
Zwiększone stężenie bilirubiny sprzężonej może być wynikiem defektu wydzielania bilirubiny do żółci (zespół Dubina-Johnsona), ale przede wszystkim wskazuje na niedrożność przewodów żółciowych. Przyczyną niedrożności może być kamica żółciowa, nowotwór lub zwężenie przewodów żółciowych.
Hiperbilirubinemia spowodowana wzrostem stężenia bilirubiny sprzężonej wiąże się z obecnością bilirubiny w moczu (bilirubinuria), podczas gdy wolna bilirubina (skompleksowana z albuminą) nigdy nie pojawia się w moczu.
Metabolizm żelaza
Żelazo odgrywa zasadniczą rolę w metabolizmie energetycznym żywej komórki, biorąc udział w utlenianiu substancji organicznych. Znaczenie biologiczne tego pierwiastka warunkują jego dwie podstawowe własności.
1. Istnienie dwóch trwałych stanów wartościowości - Fe2+ i Fe3+ - co umożliwia udział w reakcjach utleniania i redukcji.
2. Zdolność tworzenia trwałych kompleksów z wieloma związkami o bardzo różnorodnej strukturze.
Jony żelaza mogą być składnikiem hemoprotein, gdzie wbudowane są w pierścień protoporfiryny, albo mogą występować w postaci związków niehemowych. Do hemoprotein należy szereg enzymów biorących udział w procesach utleniania i redukcji (np. cytochromy, oksydaza cytochromowa, katalaza, peroksydaza) oraz białka przenoszące tlen (hemoglobina i mioglobina). Do białek niehemowych należą: białko transportujące żelazo - transferyna, białka magazynujące żelazo - ferrytyna i hemosyderyna, a także szereg enzymów np. dehydrogenaza bursztynianowa, oksydaza ksantynowa, hydroksylaza fenyloalaninowa i inne.
Całkowita ilość żelaza w organizmie dorosłego mężczyzny o masie 70 kg wynosi około 3,8 g (u dorosłej kobiety o zbliżonej masie ciała jest nieco mniejsza): w hemoglobinie znajduje się około 2,5g (65%), w ferrytynie i hemosyderynie około 1,0 g (25%), w mioglobinie i enzymach około 0,3 g (8%) i w transferynie 3-4 mg.
Żelazo zawarte w osoczu stanowi bardzo małą część całkowitej ilości żelaza w organizmie. Obrót metaboliczny żelaza jest bardzo szybki. W czasie 1 sekundy 3 miliony krwinek czerwonych ulega zniszczeniu; większość uwalnianego żelaza wraca do szpiku i jest wbudowywana w cząsteczki hemoglobiny.
Transferyna jest b1-globuliną osocza o masie cząsteczkowej około 80000. Cząsteczka apotransferyny ma zdolność do przyłączenia dwóch jonów Fe3+ w obecności HCO3-. Powstały kompleks ma budowę: transferyna - (Fe3+)2 - (HCO3-)2. W warunkach prawidłowych transferyna jest wysycona żelazem w około 30%.
Ferrytyna jest to rozpuszczalne w wodzie połączenie apoferrytyny z Fe3+. Cząsteczka apoferrytyny (m. cz. około 430000 - 480000) jest białkiem zbudowanym z 20-24 podjednostek. Wewnątrz części białkowej znajduje się około 4000-5000 atomów Fe w postaci hydroksyfosforanów żelazowych. Całkowicie wysycona żelazem cząsteczka ferrytyny zawiera 17-23% żelaza. W warunkach prawidłowych ferrytyna występuje w bardzo małych ilościach w surowicy krwi - 12-250 mg/dm3.
Dzienne wydalanie żelaza jest bardzo małe: 0,5 - 1,0 mg (przez nerki, jelito grube, w wyniku złuszczania nabłonków). W warunkach prawidłowych powinna istnieć równowaga pomiędzy wydalaniem wchłanianiem żelaza. Dieta dzienna zawiera średnio od 10 do 15 mg żelaza, z tego wchłaniane jest 5-10%, czyli około 1 mg. Stany, które wymagają większego zapotrzebowania na żelazo, np. przewlekłe krwawienia, ciąża, wzrost organizmu, stosunkowo łatwo naruszają stan równowagi i doprowadzają do utajonego niedoboru żelaza, tzn. do obniżenia jego zawartości w magazynach. Oznaczanie stężenia żelaza w surowicy nie jest dobrym wskaźnikiem dla oceny stanu magazynów.
W warunkach prawidłowych stężenie żelaza w surowicy wynosi około 120 mg/100 cm3.
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
1. Oznaczanie bilirubiny całkowitej
Zasada metody
Słabe wiązania między cząsteczkami bilirubiny i białka ulegają rozpadowi w obecności kofeiny. W środowisku zasadowym bilirubina pod wpływem diazowanego kwasu sulfanilowego przechodzi w azobarwnik.
Materiał i odczynniki
1. Wzorcowe roztwory bilirubiny – 1 mg/100 cm3, 2 mg/100 cm3, 3 mg/100 cm3,
(bilirubina rozpuszczona jest w roztworze zawierającym 0,06% NaHCO3, 0,3%
NaCl, 70% etanol).
2. Odczynnik kofeinowy (5% kofeina, 7,5% benzoesan sodu, 12,5% octan sodu).
3. Odczynnik diazo I (0,5% kwas sulfanilowy, 2% HCl).
4. Odczynnik diazo II (0,1% roztwór NaNO2).
5. Odczynnik Fehlinga II (10% NaOH, 35% winian sodowo-potasowy).
6. Surowica krwi.
Wykonanie doświadczenia
1.Przygotować 5 probówek:
-do pierwszej dodać 2 cm3 roztworu bilirubiny o stężeniu 1 mg/100 cm3
-do drugiej dodać 2 cm3 roztworu bilirubiny o stężeniu 2 mg/100 cm3
-do trzeciej dodać 2 cm3 roztworu bilirubiny o stężeniu 3 mg/100 cm3
-do czwartej dodać 2 cm3 wody (próba ślepa)
-do piątej dodać 2 cm3 surowicy
2.Do wszystkich probówek dodać po 3 cm3 odczynnika kofeinowego
3.Przygotować odczynnik diazowy - zmieszać: 10 cm3 diazo I i 0,3 cm3 diazo II
4.Do wszystkich probówek dodać po 1 cm3 odczynnika diazowego
5.Po 10 minutach dodać do wszystkich probówek po 2 cm3 odczynnika Fehlinga II
6.Próby odstawić na 10 minut (ciemność)
7.Po tym czasie próby przesączyć, próba ślepa nie wymaga sączenia
8.Zmierzyć absorbancję wobec próby ślepej przy długości fali 600 nm.
9.Zawartość bilirubiny w surowicy odczytać z wykreślonej krzywej wzorcowej – probówki 1, 2 i 3.
2. Badanie bilirubiny bezpośredniej wg Hejmansa van den Bergha
...
ludi.lg