Mikro rep2.doc

BAKTERIOFAGI:

1915 – F. Twort – odkrył wirusy bakteryjne

1917 Felix d’Herielle

Zbudowane z białka i kw. nukleinowego, DNA, lub ss/dsRNA

Bakteriofag T7:

Wstrzykuje swój materiał genetyczny, wykorzystuje polimerazę DNA bakterii do odczytania pierwszych nukleozydów DNA faga, żeby zsyntetyzować własna polimerazę. Szybko zabija. Okres latentny trwa ok. 20min (od wniknięcia do pojawiania się nowych fagów). Jedna kom. bakteryjna daje 100 fagów/min.

Liczenie fagów:

- bierzemy probówkę, nalewamy do niej agaru 0,5% - mniej gęsty

- dodajemy odpowiednie rozcieńczenie bakteriofagów

- dodajemy kroplę bakterii i mieszamy, wylewamy na płytkę

- na górnej warstwie agaru adsorbują się bakterie z zaadsorbowanymi fagami

- bakterie giną, fagi atakują kolejne bakterie itd.

- tworzą się charakterystyczne łysinki. jedna łysinka = jeden bakteriofag.

Białka fagowe:

- wczesne – niezbędne do replikacji

- późne – do budowy kapsydów, do lizy kom. bakteryjnej.

Wirus zjadliwy- atakuje i zabija, liza kom. po ok. 30min.

Bakteriofagi łagodne (umiarkowane) – mogą siedzieć w kom. przez wiele pokoleń, mogą się nagle „uzjadliwić” i spowodować lizę

Cykl lityczny – fag wstrzykuje swoje DNA do kom, następuje jego powielanie i liza kom.

Cykl lizogenny – po wstrzyknięciu DNA do komórki ten wbudowuje się w chromosom bakteryjny (lizogenizacja) i egzystuje w nim jako profag. Dzieli się razem z komórką. Podobnie dzieje się u retrowirusów.

Bagteriofag Lambda:

Dwuniciowy DNA, którego końce są częściowo jednoniciowe (lepkie końce) – są one do siebie komplementarne, co umożliwia jego zamknięcie w formę kolistą. Liniowy DNA jest dłuższy od kolistego o 12 nukleotydów. Liniowe jest wewnątrz faga, po wstrzyknięciu zamyka się.

Wycinanie faga, np. przez UV – może nie być idealne i może wyciąć się kawałek chromosomu bakterii, a zostanie kawałek genomu wirusa.

Bakteriofag z kawałkiem genomu bakteryjnego przy kolejnym ataku na inną komórkę przeniesie na nią te geny (np. gal i lac) – komórka nabędzie nową cechę à transdukcja.

Przykłady transdukcji:

- bakteriofag Vi atakujący Salmonella typhi, przekazują informację o modyfikacji cukru Vi (wirulencyjny antygen otoczkowy)

- bakteriofag Vi2 wykorzystywany do typowania fagowego. Przyczepia się do wielocukru Vi na pow. kom.

Konwersja lizogenna – bakteria nabiera nowej cechy na drodze lizogenizacji.

- synteza toksyny przez Corynebacterium diphtheriae – bakteriofag β.

- przekazywanie genów toksyny botulinowej u Clostridium botulinum

- toksyna erytrogenna (płonica) – Streptococcus (erytrogennae??) [pyogenes chyba…]

- Vibrio cholerae – nabył cechę syntezy toksyny cholery przez otrzymanie genu tox od bakteriofaga.

IDENTYFIKACJA BAKTERII: (met. molekularne i szeregi biochem.)

Metody molekularne:

Analiza numeryczna:

Cechy nie są równocenne, np. do fermentacji laktozy trzeba 2 genów, a do budowy rzęski kilkudziesięciu.

W analinie numerycznej analizujemy wiele cech i przypisujemy im tę samą wartość. Jeśli analizujemy ten sam szczep to 100% tych samych cech. Jeżeli 2 szczepy wykazują ≥ 90% podobieństwa to należą do tych samych gatunków.

Ilość par G≡C w genomie. Różne bakterie mają różną % zawartość G i C w DNA. Jeśli dwa szczepy są takie same – to ilość G i C jest taka sama, jednak mogą być dwa szczepy o takiej samej zawartości i nie być takie same. Sama zawartość G i C słabo charakteryzuje szczepy.

Hybrydyzacja – proces łączenia dwóch fragmentów DNA. Jeśli fragment DNA jest komplementarny do sondy to się przyłączy (nastąpi hybrydyzacja). Stopień hybrydyzacji jest wskaźnikiem podobieństwa DNA – element diagnostyki molekularnej. [Szybkość hybrydyzacji DNA z dwóch różnych genomów jako miara pokrewieństwa (z wikipedii…)].

16sRNA. Jeśli 2 szczepy mają być identyczne, to podobieństwo tkwi w DNA. W toku ewolucji z 1 org. mogą powstać 2 w skutek zróżnicowania się DNA. Różnica w DNA może być miarą odległości ewolucyjnej dwóch org. Ważna jest różnica w rybosomalnym RNA, gdyż jest to składnik do syntezy białek – ważny i wolno ewoluuje. W RNA rybosomalnym są pewne charakterystyczne sekwencje dla organizmu z którego się wywodzi (seksencje signature). Mówi o stanie pokrewieństwa między 16sRNA jest lepsze (ok. 1500 par zasad – wystarczająco) od 23sRNA.

16sRNA pozwala ustalić gł. gałęzie ewolucyjne wszystkich organizmów. Obok sekwencji signature występują też sekwencje które szybciej się zmieniają się w czasie. Ilość zmian która pojawia się w tych fragmentach jest miarą pokrewieństwa i pozwala określić kiedy gałęzie się rozeszły.

PCR (Polimeraze Chain Reaction)

Potrzeba: nukleotydy, polimeraza Taq (termostabilna polimeraza DNA), matryca DNA, startery (krótkie odc. DNA), bufor, jony Mg2+.

W 94°C nici rozchodzą się, po oziębieniu do 50°C może nastąpić hybrydyzacja (komplementarna startery przyłączają się do matrycy – konkurują z fragmentami DNA), następnie temp. wzrasta do 72°C – optymalna dola działania polimerazy Taq, która dobudowuje kolejne nukleotydy.

Jeśli szukamy danej sekwencji DNA musimy mieć odpowiednie startery, które ją znajdą. Otrzymamy wiele kopii. Sekewncje między 2 signature można zidentyfikować na żelu (pewnie elektroforezą…).

Restrykcja (cięcie) i modyfikacja (metylacja).

Bakteria broni się w ten sposób przed DNA bakteriofaga. Enzymy restrykcyjne – EcoR1 – enzym endonukleaza, rozpoznaje GAATTC – tworzy lepkie końce. Metylaza dodaje gr. metylowe do tej sekwencji i EcoR1 nie może uciąć własnego DNA. DNA bakteriofaga nie jest metylowane.

SV40 – wirus atakujący małpy, enzym HindIII – tnie plazmid. (???)

Rozdział elektroforetyczny zależy od masy cząsteczki. DNA na ład (-), więc wędruje w kierunku anody (+). Im dłuższy odcinek tym wolniej.

Prokariota – mRNA policistronowe – kodujące kilka białek

Eukariota – mRNA monocistronowe – kodujące dokładnie jedno białko. hnRNAàsplicing, dodanie czapeczki (5’) i ogona poli-A (3’).

Biblioteka genomowego DNA.

Żeby przechować DNA potrzebny jest wektor – np. plazmid, fagowy DNA.

- DNA myszy traktuje się enz. restrykcyjnymi, które je tną, otrzymujemy fragmenty z lepkimi końcami.

- wektor tnie się enzymem restrykcyjnym – powstaje lepki koniec komplementarny do lepkiego końca fragmentu mysiego.

- powstaje plazmid, lub fagowy DNA mający w sobie fragment mysiego DNA.

- wektor umieszcza się w kapsydzie lub kom. bakteryjnej (transformacja) i powstaje bakteria lub fag z fragmentem mysiego DNA.

- każda komórka lub fag ma inny fragment DNA, które można potem skleić.

Jeśli lepkie końce nie pasują do siebie, albo są tępe – Można dokleić dwuniciowy DNA – linker (łącznik) zawierający miejsce restrykcyjne.

Biblioteka cDNA. (komplementarnego DNA)

Biblioteka genomowego DNA ma masę smieci, np. introny, a nas interesują sekwencje kodujące białka.

Punktem wyjściowym jest mRNA (nie zawiera intronów, jedynie sekwencje niekodujące przy 5’ i 3’), jednak jest on nietrwały.

- bierzemy starter poli-T (komplementarny do poli-A).

- odwrotna transkryptaza dobudowuje pierwszą nić DNA

- pozbycie się nici RNA.

- do nici z poli-T dobudowuje się po jej spronie 3’ sekwencję CCC

- do CCC dołącza się starter GGG i polimeraza DNA dobudowuje komplementarną nić.

- dodajemy końce wiszące C na 3’ obu nici– powstają lepkie końce - można wsadzić do wektora.

Bibliotek chromosomalna jest większa, bo posiada egzony i introny, a bibl. cDNA jest oparta o mRNA i nie zawiera intronów.

Pierwsza szczepionka rekombinacyjna (przeciw WZW-B)

Znajdujemy gen kodujący białka kapsydu (antygen powierzchniowy), umieszczamy go w plazmidzie, a plazmid w kom. drożdży. Hoduje się drożdże, następnie rozbija komórki z plazmidem i izoluje wirusowe białka w kolumnie chromatograficznej. Wadą jest to że szczepionka może być zanieczyszczona białkami drożdży – alegrie.

Pozyskiwanie insuliny:  (???)

Transpozycja

proces przemieszczania się transpozonu na inną pozycje w genomie tej samej komórki.

Transpozon - sekwencja DNA, która może przemieszczać się na inną pozycje w genomie tej samej komórki.

Sekwencja IS – sekwencja insercyjna, umożliwia transpozycję, Gen znajdujący się pomiędzy sekwencjami IS może być wycięty i przenoszony.

Tn1, Tn2, Tn3 – oporność na ampicylinę

Tn4 – oporność na ampicylinę, streptomycynę, sulfonamid.

Tn5 – op. na kanamycynę

Tn951 – operon laktozowy

Tn10 – op. na tetracyklinę

Transpozycja może dotyczyć przeniesienia fragmentu plazmidu na chromosom, lub przeniesienia w obrębie chromosomu

Bakterie chorobotwórcze dla człowieka:

Yersinia pestis

Vibrio cholerae

Treponema Pallidium

Bacillus anthracis

Clostridium botulinum

Bordetella sp. (krztusiec)

Bakterie oportunistyczne

E. coli

Clostridium tetani, perfringens

Kliebsiella pneumoniae

Streptococcus pneumoniae

Straphylococcus aureus

Serratia marcescens

Proteus mirabilit

Bakterie patogenne w niektórych sytuacjach (np. rany)

Straphylococcus epidermidis

Enterobacter aerogenes

Cechy które warunkują chorobotwórczość:

Możliwość oddziaływania z czymś na powierzchni ciała, np. z receptorami dla wiązania ligandów, np. Haemophillus influenza – atakuje górne drogi oddechowe, niektóre szczepy atakują gałkę oczną (inne receptory), Streptococcus pyogenes (nos, gardło). Po narodzeniu dziecko jest odporne na streptokoki, bo nie ma jeszcze odpowiednich receptorów.

E. coli – wytwarza śluz, który umożliwia przyczepienie się do nabłonka w jelicie. Ale Vibrio cholerae nie wytwarza żadnych śluzów. Streptococcus mutant – adhezja na zębach dzięki śluzowi. Wirusy też oddziałują z receptorem.

Endocytoza – bakterie przyczepiają się do nabłonka, wnikają do środka, uszkadzają błonę podstawną i przedostają się do krwiobiegu. Szczepy inwazyjne.

Riketsja – może egzystować tylko we wnętrzu naszych komórek – chronione przed układem immunologicznym i antybiotykami.

Straphylococcus aureus – wytwarza koagulazę à tworzenie skrzepów à brak dostępu komórek ukł. immuno. Wydzialają też leukocydyne, która zabija fagocyty.

Mycobacterium tuberculosis – zmienia powierzchnię fagosomu, tak że lizozymy nie mogą się z nim łączyć

Yersinia pestis – może się namnażać wewnątrz fagosomu, unika działania enzymów

Streptococcus pneumoniae – chroni się otoczką

Czynniki wirulencji: rzęski, otoczki, fimbrie, glikokaliks, enzymy, np.:

- fibrynolizyna – rozkłada fibrynę

- hialuronidaza

- lecytynaza – uszkadza błonę kom

- koagulaza

- streptokinaza (fibrynolitycznie)

Toksyny:

Leki infuzyjne powinny być sprwadzone na obecność endotoksyn:

* Test LAL:

Surowica skrzypłocza jest ścinana przez endotoksynę. Test pozwala wykryć 5-10pg/ml

Egzotoksyna może przejść w toksoid (anatoksynę) pod wpływem formaliny, temp.

Szczepy E. coli:

ETEC (enterotoksyczne) – bakterie są poza nabłonkiem, słaba adhezja, wydzielają toksynę przenikającą so nabłonka. Szczep nieinwazyjny

EHEC (enterokrwotoczne) – niszczy kosmki nabłonka jelitowego, „siada” na siodełku (wtf?) białko intimina uszkadza kom, termostabilna toksyna Shiga, szczep inwazyjny

EAEC (enteroagregacyjne) – wytwarzają pęczek rzęsek oddziałujących z nabłonkiem

EPEC (enteropatogenne) – też siada na siodełku, wytwarza intiminy, ale nie wytwarza toksyn, szczep inwazyjny. Posiada gen EAE kodujący intiminę, koduje cechy patogenne

EIEC (enteroinwazyjne) – rozprzestrzenia się po całym organizmie.

Wyspa patogenności (???)

EAF – czynnik adherencji – jak go wykryć? Komplementarną sondą – fragment plazmidu.

Często szczepy E.coli nieposiadające plazmidów są nieszkodliwe dla człowieka.

Toksyna Corynebacterium diphtheriae – działa na biosyntezę białka. Ma dwa komponenty – podj. B umożliwia przyczepienie się do receptora, podj. A wnika do środka i poprzez rybozylację wpływa na EF-2.

Toksyna Vibrio cholerae – 2 podj: B (pentametr) łączy się z receptorem i A – wchodzi do środka, stymuluje wytwarzanie cAMP, co powoduje wychodzenie wody i jonów do światła jelita à biegunka

...