LM2-Paciorkowceinstrukcja.doc

W tabeli  przedstawiono uproszczoną klasyfikację paciorkowców i ich rolę w zakażeniach

CHARAKTERYSTYKA MORFOLOGICZNA PACIORKOWCA ROPNEGO (S.pyogenes)

Jest to ziarenkowiec Gram(+) zaklasyfikowany do grupy A na podstawie obecności swoistego wielocukru w ścianie komórkowej. Węglowodany ściany komórkowej paciorkowców zostały po raz pierwszy scharakteryzowane w roku 1930 przez panią Rebekę Lancefield i podział ten jest aktualny do dzisiaj. W obrębie paciorkowców grupy A swoiste białka ściany komórkowej typu M, T, R pozwalają na zróżnicowanie 80 różnych serotypów tego drobnoustroju. Warto pamiętać, że grupowe wielocukry ściany komórkowej paciorkowców nie są czynnikami zjadliwości tych bakterii.

Białko M swoiste dla określonego typu, oporne na temperaturę, a wrażliwe na trypsynę jest podstawowym składnikiem fimbrii - wypustek protoplazmatycznych. Wykazano, że białko to charakteryzuje się pokrewieństwem antygenowym z sarkolemmą mięśnia sercowego i jest odpowiedzialne za nadwrażliwość typu późnego w testach skórnych.

Białko typu T jest antygenem opornym na trypsynę, występuje w kilku odmianach antygenowych, jest obecne również w szczepach należących do innych grup serologicznych np. C i G. Białko T jest podstawą typowania paciorkowców do celów epidemiologicznych.
Wykazano, że białko T i R może także tworzyć składowe fimbrii.

Ściana komórkowa odpowiedzialna za kształt komórki ma budowę kompleksową, składa się z peptydoglikanu, węglowodanów oraz kwasów lipotejchowych (LTA) oraz wcześniej tego Drobnoustroje mają kształt okrągły, układają się w postaci krótkich lub dłuższych łańcuszków, barwią się na kolor fioletowy w metodzie Grama (Gram+). Do wzrostu wymagają bogatych składników odżywczych np. odwłóknionej krwi lub surowicy. Optymalna temperatura wzrostu wynosi 37°C mogą rosnąć w warunkach beztlenowych. Na podłożach stałych z dodatkiem krwi powodują całkowite rozpuszczenie krwinek manifestujące się odbarwieniem podłoża (hemoliza). Czasem tworzą kolonie śluzowe, co uwarunkowane jest obecnością otoczki z kwasu hialuronowego. Większość szczepów ma na stałe zintegrowanego w genom bakteriofaga łagodnego, który służy jako wektor informacji genetycznej np. tylko szczepy lizogenne są zdolne wytwarzać toksynę pyrogenną (Spe). Niektóre szczepy paciorkowca ropnego opornego na antybiotyki makrolidowe są nośnikami pozachromosomalnego materiału genetycznego w postaci plazmidu R.

Wszystkie szczepy paciorkowców grupy A są wysoce wrażliwe na penicylinę. MIC penicyliny dla większości z nich wynosi 0,016 µg/ml; lub mniej. Wszystkie paciorkowce grupy A są wrażliwe na bacytracynę i właściwość tę wykorzystano do ich szybkiej identyfikacji i odróżnienia od innych grup w warunkach in vitro.

Pierwszym etapem zakażenia jest kolonizacja błon śluzowych górnych dróg oddechowych. Wiadomo jednak, że śluzówki gardła są chronione przed kolonizacją przez stałe spłukiwanie ich powierzchni śliną. Zatem bakterie kolonizujące śluzówki muszą mieć właściwości przylegania do komórek śluzówkowych. Przez wiele lat przypuszczano, że głównymi adhezynami paciorkowców ropnych są fimbrie tworzące białko M oraz kwasy tejchowe. Okazało się jednak, że główną adhezyną paciorkowca jest powierzchniowe białko F odpowiedzialne za przyleganie bakterii do komórek śluzówki gardła. Białko F ma zdolność wiązania fibronektyny komórek nabłonkowych.
Prawdopodobnie białko M odpowiedzialne jest za wiązanie paciorkowca ropnego z keratocytami skóry. Jednym z późnych powikłań anginy paciorkowcowej jest reumatyczne zapalenie stawów.
Wykazano, że szczepy powodujące to powikłanie posiadają grubą otoczkę z kwasu hialuronowego, która powoduje, że na podłożach stałych kolonie paciorkowca mają wygląd śluzowy.

Warto pamiętać, że kwas hialuronowy jest składnikiem tkanek człowieka i nie posiada właściwości immunogennych, w odróżnieniu od bakteryjnego, który stymuluje układ odpornościowy do syntezy swoistych przeciwciał. Otoczki z kwasu hialuronowego podobnie jak wszystkie inne otoczki bakteryjne mają właściwości antyfagocytarne. Chronią bakterie rosnące na powierzchni śluzówek przed zabiciem przez fagocyt. Otoczki opóźniają także proces rozpoznania bakterii przez układ odpornościowy człowieka, jednak nie chronią przed nim całkowicie, bowiem wiadomo, że nieleczona angina paciorkowcowa ulega samowyleczeniu. Właściwości antyfagocytarne ma także białko M. Warto jednak pamiętać, że gorączkę reumatyczną mogą powodować także szczepy nie posiadające otoczki z kwasu hialuronowego. Główne objawy paciorkowcowego zapalenia gardła jak obrzęk, ból oraz tworzenie ropni wiąże się ze zdolnością paciorkowca do powodowania odczynu zapalnego. Dwa typy produktów wytwarzanych przez paciorkowce mogą powodować odpowiedź zapalną. Jednym z nich są enzymy hydrolityczne jak hemolizyny, proteazy, DNA-zy, streptokinaza oraz streptolizyny (O, S).

Streptolizyna O jest toksyną, której budowa chemiczna oraz mechanizm działania przypomina pneumolizynę dwoinki zapalenia płuc. Streptolizyna działa bezpośrednio toksycznie na erytrocyty powodując tworzenie otworów w błonie protoplazmatycznej i lizę komórki. Streptolizyna uszkadza także szereg innych komórek np. komórek tkanki sercowej. Toksyna ta ma silne właściwości immunogenne, co sprawia, że osoby chore mają wyraźnie podwyższony

Niektóre lizogenne szczepy Str.pyogenes wytwarzają toksynę pyrogenną (erytrogenną) Spe o zróżnicowanej budowie antygenowej (typ A, B, C) odpowiedzialną za wysypkę w szkarlatynie. Okazało się, że egzotoksynę podobną do Spe typu A wytwarzają także szczepy S.pyogenes powodujące inwazyjne zakażenie u osób skądinąd zdrowych, które charakteryzuje się wstrząsem, niewydolnością wielonarządową i jest obarczone wysoką śmiertelnością. Mechanizm działania toksyny pyrogennej typu A (TSLS - toxic shock like syndrome) jest podobny do mechanizmu działania toksyny wstrząsu toksycznego TSST-1 wytwarzanej przez niektóre szczepy gronkowca. Sugeruje się, że szczepy S.pyogenes wytwarzające Spe A są odpowiedzialne za niezwykłą zjadliwość szczepów TSLS. Wykazano także, że reumatogenne szczepy Str.pyogenes odpowiedzialne za anginę wytwarzają również Spe - o właściwościach superantygenu odpowiedzialnego za późne powikłanie jakim jest gorączka reumatyczna.

Wszystkie istniejące teorie próbujące wyjaśnić mechanizm gorączki reumatycznej są niedoskonałe i nie potrafię odpowiedzieć na pytanie dlaczego nawet późne podanie antybiotyku, tj. do 9 dni od zakażenia zapobiega powikłaniu i dlaczego gorączka reumatyczna charakteryzuje się tendencją do nawrotów, a nawrót zakażenia jest podobnie odległy w czasie jak w przypadku pierwszego epizodu. Tylko około 25% szczepów paciorkowca ropnego powodującego zapalenie gardła powoduje późne powikłania w postaci gorączki reumatycznej. Powikłanie to pojawia się po kilku tygodniach od przebycia zakażenia.

Drugim typem substancji odpowiedzialnych za proces zapalny są elementy strukturalne komórki jak peptydoglikan oraz kwasy tejchojowe aktywujące dopełniacz oraz wyzwalające syntezę cytokin prozapalnych (IL-1, TNF). Zróżnicowana zjadliwość szczepów paciorkowca ropnego lub odporność gospodarza na zakażenie tłumaczy bezobjawowe nosicielstwo tego drobnoustroju bez jakichkolwiek późnych powikłań.

Szczepy paciorkowca ropnego izolowane od chorych z nosicielstwa wykazują odmienną budowę białka M, co może tłumaczyć ich ucieczkę przed układem odpornościowym gospodarza.

DIAGNOSTYKA PACIORKOWCÓW

Klasyczna diagnostyka paciorkowcowego zapalenia gardła polega na:

Standardowym badaniem jest posiew wymazu pobranego z tylnej ściany gardła i powierzchni migdałków na odpowiednie podłoża bakteriologiczne. Podstawowym podłożem do hodowli paciorkowców ropnych jest agar krwawy umożliwiający określenie typu hemolizy (patrz tabela), której występowanie warunkuje streptolizyna O. Najprostszym testem pozwalającym zróżnicować paciorkowce grupy A od innych grup serologicznych jest wrażliwość na bacytracynę. Około 95% szczepów paciorkowca ropnego jest wrażliwych na bacytracynę, podczas gdy 99% opornych na bacytracynę β-hemolizujących paciorkowców należy do innych grup. Warto pamiętać, że tylko paciorkowce grupy A są odpowiedzialne za późne powikłania typu gorączki reumatycznej. Czułość hodowli wynosi 90%, co wskazuje, że ujemny wynik całkowicie nie wyklucza możliwości anginy paciorkowcowej.

Pneumokoki – S. pneumoniae (dwoinka zapalenia płuc)

Jest etiologicznym czynnikiem płatowego zapalenia płuc i najczęstszą przyczyną bakteryjnego zapalenia płuc u człowieka. Czynnikiem zjadliwości jest gruba otoczka polisacharydowa wykazująca silne działanie antyfagocytarne.. Wytwarza agresyny i inwazyny: pneumolizyny i leukocydyny.

Cechy hodowlane i różnicowanie

Paciorkowce mają duże wymagania wzrostowe. Są względnymi beztlenowcami. Izoluje się je na podłożach zawierających wyciąg sercowo-mózgowy, dodatkowo wzbogacony krwią lub surowicą.

Pożywki wybiórcze pozwalające na izolowanie paciorkowców z materiału klinicznego zawierają 0,02% azydku sodowego, który hamuje wzrost gramujemnej flory towarzyszącej. Na pożywkach stałych z krwią tworzą otoczone strefą hemolizy kolonie.

Ważniejsze testy wykonywane w różnicowaniu paciorkowców

Identyfikacja serologiczna grup paciorkowców

Wykorzystuje się czynny wielocukier C, który izoluje się z komórek wyizolowanych szczepów na drodze ekstrakcji enzymatycznej lub chemicznej (zestawy farmaceutyczne) – precypitacja z surowicami A,C,G

Test wrażliwości na bacytracynę (test krążkowy)

Test ten różnicuje paciorkowce β-hemolizujące. Szczególna wrażliwość na nawet bardzo małe jej stężenia wykazują paciorkowce grupy A (S.pyogenes). Zahamowanie wzrostu wokół krążków > lub = 15 mm uważa się za wynik dodatni – szczep wrażliwy. Jeżeli strefa jest < to przynależność do gatunku potwierdzić innymi testami.

Wrażliwość na kotrimoksazol (SXT) (sulfometaksazol+trimetoprim) –służy do różnicowania paciorkowców β-hemolizujących. Paciorkowce grupy A i B są oporne, grupy C są wrażliwe.

Test wrażliwości na optochinę

W sposób wybiórczy hamuje wzrost Streptococcus pneumoniae, co odróżnia te dwoinki od innych paciorkowców – α hemolizujących wrażliwych na znacznie większe stężenia tego związku. Zahamowanie wzrostu wokół krążka uważa się za wynik dodatni.

Rozpuszczalność w żółci

Próba jest pomocna w identyfikacji S.pneumoniae. Sole żółci uaktywniają autolizyny, co prowadzi do rozpuszczenia komórek -widoczne gołym okiem. Na kolonie nakroplić 2% deoksycholan sodu, inkubować 30 min w 37○C.

Wykrywanie hydrolizy eskuliny

Eskulina fluoryzuje w świetle UV o długości fali 360 nm. Hydroliza związku prowadzi do zaniku fluorescencji. Powstająca z eskuliny  eskuletyna daje czarne zabarwienie z jonami żelazowymi. Stosuje się pożywki z 0.1% eskuliną i cytrynianem żelazowym. Inkubacja w 35 st.C. bakterie hydrolizujące eskulinę zaczerniają podłoże, utrata fluorescencji.

Wykrywanie zdolności do redukcji TTC chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolinowego – wzrost w postaci ciemnoczerwonych koloni – praktyczne zastosowanie do różnicowania Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium

Rozkład hipuranu sodu do glicyny, glicynę wykrywa się odczynnikiem ninhydrynowym – niebieski zabarwienie – reakcja dodatnia.

Test PYR – służy do różnicowania rodzajów Enterococcus i Streptococcus. Wykrywany jest w nim enzym L-pyrolidonyloaryloamidaza – wytwarzany tylko przez niektóre z nich. Odszczepiany jest β-naftylamid z substratu. Uwolniony związek z barwnikiem diazowym tworzy kompleks o barwie różowo-czerwonej.

Podstawowe reakcje do odróżniania paciorkowców kałowych od paciorkowców zieleniejących:

1.     paciorkowce kałowe - Enterokoki - dobrze rosną na zwykłych podłożach.

2.     badanie wzrostu w mleku zawierającym 0.1% błękit metylenowy

3.     wzrost w podłożu bulionowym o pH 9.6

4.     wzrost w temp.10 - 45 st. C

5.     zdolność wzrostu na podłożu z żółcią i eskuliną (rozkład eskuliny, wzrost na podłożu z 40% żółcią)

6.     hemoliza – zwykle nie hemolizują lub β-dla E.faecalis, α-dla E.faecium

7.     oporność na ogrzewanie w 60 st.C przez 30 min.

10.wzrost w obecności 6.5% NaCl

Zdolność do rozkładu arabinozy odróżnia E.faecalis od E.faecium

Testy API 20 Strep-Kit wykonane dla Streptococcus pyogenes, E.faecalis i  E.faecium, Streptococcus pneumoniae;

bioMérieux® sa Polski - 1

REF 20 600 07625E - PL - 2003/01

®

20 Strep

System do identyfikacji Streptococcaceae i drobnoustrojów spokrewnionych

WPROWADZENIE

System API 20 Strep jest wystandaryzowanym zestawem

zawierającym 20 testów biochemicznych, który daje

szerokie możliwości. Umożliwia on identyfikację grup lub

gatunków większości paciorkowców i enterokoków oraz

najbardziej powszechnych spokrewnionych drobnoustrojów.

Pełna lista organizmów, które można

zidentyfikować przy użyciu tego systemu jest podana na

końcu niniejszej instrukcji w Tabeli Identyfikacyjnej.

ZASADA DZIAŁANIA

Pasek API 20 Strep składa się z 20 mikroprobówek

zawierających odwodnione substraty umożliwiające ocenę

aktywności enzymatycznej lub fermentacji cukrów.

Testy enzymatyczne posiewa się gęstą zawiesiną

drobnoustrojów, odtwarzającą substraty enzymatyczne,

przygotowaną z czystej hodowli. Procesy metaboliczne

zachodzące podczas inkubacji powodują zmiany koloru,

które są albo spontaniczne, lub wywołane przez dodanie

odczynników.

Testy fermentacyjne posiewa się podłożem

wzbogaconym, które uwadnia substraty cukrowe.

Fermentacja węglowodanów jest wykrywana dzięki

zmianom barwy wskaźników pH.

Po odczytaniu reakcji według Tabeli Odczytów, otrzymuje

się identyfikację przez porównanie z Książką Kodów lub

stosując program komputerowy.

ZAWARTOŚĆ ZESTAWU (Zestaw na 25 testów):

- 25 pasków API 20 Strep

- 25 komór inkubacyjnych

- 25 ampułek API GP Medium

- 25 kart wyników

- 25 wymazówek *

- 1 instrukcja

* Zastosowanie tych wymazówek jest ograniczone

wyłącznie do pobierania materiału z kolonii

bakteryjnych uzyskanych na podłożach hodowlanych.

Nie należy stosować ich do pobierania próbek

bezpośrednio od pacjentów.

SKŁAD

Pasek

Skład paska API 20 Strep podano w tej instrukcji w Tabeli

Odczytów.

...