BIOTECHNOLOGIA
Wiesław Przybylski
WYKŁAD 1 7.10.10r.
Znaczenie gospodarcze i społeczne biotechnologii we współczesnym świecie
Konwencja o różnorodności biologicznej ONZ: biotechnologia oznacza zastosowanie technologiczne, które używa systemów biologicznych, organizmów żywych lub ich składników, żeby wytwarzać lub modyfikować produkty lub procesy o określonym zastosowaniu.
Biała biotechnologia – zastosowanie w przemyśle. Wykorzystuje ona żywe komórki, np. pleśni, bakterii oraz enzymy do wytwarzania nowych produktów lub inicjowania procesów przetwórczych. Mikroorganizmy wykorzystywane w białej biotechnologii są zwykle zmodyfikowane przy zastosowaniu inżynierii genetycznej.
Czerwona biotechnologia jest związana z medycyną i ochroną zdrowia, a wykorzystuje się ją przy tworzeniu nowych leków, w diagnostyce, profilaktyce i leczeniu dotychczas nieuleczalnych chorób. Ulepszone mikroorganizmy wytwarzają antybiotyki, witaminy, szczepionki i białka na użytek medycyny. Preparaty biotechnologiczne stanowią obecnie ok 20% sprzedawanych lekarstw.
Biotechnologia czerwona - „zielona rewolucja” w rolnictwie
Wykorzystanie:
- ulepszanie gatunków roślin uprawnych o dużym znaczeniu gospodarczym
Zmodyfikowane zostało większość roślin mających znaczenie dla człowieka
Cele modyfikacji:
- odporność na herbicydy – chemiczne środki ochrony roślin (soja, rzepak)
- odporność na szkodniki – modyfikacja Bt (kukurydza, bawełna)
- odporność na choroby wirusowe, grzybowe, bakteryjne
- odporność na niekorzystne warunki środowiska
- poprawa lub nadanie nowych cech jakościowych
WYKŁAD 2 14.10.2010r.
BIOLOGICZNE PODSTAWY PROCESÓW MIKROBIOLOGICZNYCH
Mikroorganizmy w biotechnologii
Pozyskiwanie szczepów o znaczeniu technologicznym (skrining), obejmuje zespół zabiegów mających na celu wykrycie i wyizolowanie spośród dużej liczby możliwych drobnoustrojów tych, które odpowiadają stawianym wymaganiom technologicznym.
Mikroorganizmy o użytecznych właściwościach technologicznych stanowią nieznaczną część ich ogólnej populacji w badanej próbce. Z tego powodu niezbędna jest wstępna obróbka próbki w celu wzbogacenia udziału drobnoustrojów o poszukiwanych cechach.
Charakterystyka oraz kryteria doboru organizmów
O powodzeniu mikrobiologicznej produkcji różnych metabolitów jest wyselekcjonowanie spośród wielu gatunków i rodzajów mikroorganizmów odpowiednio aktywnego szczepu produkcyjnego.
Szczepy takie, powinny odpowiadać następującym kryteriom:
- muszą być niepatogenne
- nie mogą wytwarzać toksycznych metabolitów
- muszą wykazywać stabilność biologiczną (nie ulegać degeneracji)
Ocena cech użytkowych drobnoustrojów przemysłowych
- wydajność i szybkość tworzenia produktu
- wzmożona produkcja określonych metabolitów oraz nadawanie prawidłowych cech organoleptycznych produktom
- szybkość wzrostu
- stabilność genetyczna i fenotypowa oraz fagooporność
- wymagania pokarmowe oraz tolerancje na zmienne warunki środowiska
- czystość i łatwość wydzielania wytworzonego produktu
Skrining szczepów
- Najstarsza metoda skriningu szczepów produkcyjnych to izolowanie ich ze środowisk naturalnych (gleba oraz produkty naturalne). Występujące w nich bakterie, promieniowce i grzyby mikroskopowe zdolne do biosyntezy (antybiotyków), rozkładu (białek) czy biotransformacji (związków steroidowych).
- Mniej typowe źródła drobnoustrojów: zbiorniki wodne o bardzo dużym zasoleniu, miejsca stale zanieczyszczane ropą naftową, okolice gejzerów, odpady poflotacyjne zakładów przerabiających rudy metali ciężkich.
Metody otrzymywania czystych kultur
- metoda rozcieńczeń Listera,a następnie metoda płytkowa Kocha (→ metoda posiewu redukcyjnego → metoda posiewu powierzchniowego → metoda wgłębna, czyli płytek lanych)
- metoda kropelkowa Lindnera (stosowana głównie w przypadku czystych kultur drożdży i grzybów strzępkowych)
- metoda izolowanie czystych kultur z zastosowaniem mikromanipulatora (zalecana w badaniach naukowych)
- pomocnicze metody wyodrębniania czystych kultur, bazujące na wykorzystaniu różnic fizjologicznych i biochemicznych drobnoustrojów
Stabilność cech drobnoustrojów przemysłowych
Powtarzalność procesów biotechnologicznych
- zabezpieczenie czystości mikrobiologicznej
- zabezpieczenie maksymalnej żywotności szczepów drobnoustrojów przemysłowych
- utrzymanie pożądanych cech technologicznych
Stosowana metoda przechowalnicza powinna
- zapewnić maksymalną przeżywalność komórek
- zminimalizować liczbę komórek uszkodzonych
- przeciwdziałać spontanicznym mutacjom i selekcji odmian mniej przydatnych w procesie technologicznym
- ograniczyć przypadkowe zanieczyszczenia
Zamrażanie kultur
- zamrażanie tradycyjne: namnożoną biomasę lub komórki zebrane ze skosów przechowuje się w specjalnych fiolkach w zamrażarce, w temp. - 5 do – 20 st. C, gdzie zachowują swoją żywotność od 1 do 2 lat
- metody nowsze: zamrażanie w specjalnych zamrażarkach mechanicznych w niskiej temp. Od -60 do -80 st. C lub przy wykorzystaniu ciekłego azotu w temp od -156 do -196 st. C
- tempo zamrażania: wolne – ok 1 st. C/ min. lub bardzo szybkie 0 od 100 do 1000st. C/ min. Zazwyczaj 1 – 2 st. C/min, dopóki nie uzyska się temperatury kilka stopni powyżej punktu zmiany faz, tj ok -30 st. C. w dalszym etapie temp zamrażania jest większe, co uzyskuje się przez umieszczenie pojemników z ampułkami w pojemniku z ciekłym azotem.
Przygotowanie do zamrażania kultur
- hodowla pod zwiększonym ciśnieniem osmotycznym w obecności zwiększonej zawartości cukrów (np. 6%) oraz alkoholi polihydroksylowych (mannitol, ksylitol, glicerol)
- powoduje to gromadzenie w komórkach niskocząsteczkowych substancji (prolina, walina i glicyna):
- działają krioochronnie, obniżają temperaturę zamrażania wody
- chronią biopolimery (kwasy nukleinowe i enzymy) przez uszkodzeniami
Etapy zamrażania kultur
- hodowla adaptacyjna w pożywce z podwyższonym ciśnieniem osmotycznym (pożywka mineralna z dodatkiem 6% mannitolu)
- przygotowanie mieszaniny krioochronnej
- zawieszenie komórek w mieszaninie krioochronnej
- głębokie zamrożenie w ciekłym azocie
Rozmrażanie kultur
- decydującą rolę w zachowaniu żywotności komórek odgrywa sposób rozmrażania, które powinno przebiegać możliwie szybko, abynie dochodziło do wtórnego rozrastania się kryształów lodu i zniszczenia komórek
- najczęściej proces rozmrażania przeprowadza się przez zanurzenie ampułek z zamrożonym materiałem do wody o temp. Ok 40 st. C. Po rozmrożeniu należy usunąć lub rozcieńczyć mieszaninę krioochronną w celu zmniejszenia ciśnienia osmotycznego
- hodowla namnożonych komórek powinna być przeprowadzona w pożywce o składzie umożliwiającym dobrą regenerację i wzrost komórek
Suszenie czystych kultur
- najprostszy sposób to suszenie hodowli bezpośrednio na podłożu wzrostowym. Zastosowanie do utrwalania grzybów strzępkowych, które obficie zarodkują. Suche konidia mogą utrzymać dużą żywotność nawet przez kilka lat
- modyfikacja metody: suszenie próżniowe w eksykatorze z substancją higroskopijną (np. P2O5) w temp. Pokojowej
- przechowywanie........
Suszenie rozpyłowe
- metodę stosuje się w utrwalaniu biomas bakterii, drożdży, preparatów enzymatycznych i antybiotyków
- przy dużym stopniu dyspersji roztworów, odparowanie wody następuje praktycznie momentalnie, dzięki czemu czynnik suszący o wysokiej temperaturze nie powoduje dużych strat ich aktywności
Zalety suszenia rozpyłowego
- wysoka jakość gotowego produktu (biopreparatów z niewielką stratą aktywności biologicznej)
- duża intensywność wymiany ciepła między rozpylanych roztworem a ogrzanym czynnikiem suszącym, zależna od temperatury i wilgotności czynnika suszącego oraz dyspersji roztworu (wielkości kropel)
- możliwość automatycznego sterowania procesem
- odwadniania roztworów systemem ciągłym
Wady tej metody
- mała wydajność odparowania wilgoci w jednostce objętości komory suszenia, co wymusza projektowanie dużych rozmiarów komór
- relatywnie duże jednostkowe zapotrzebowanie na energię
- duże koszty inwestycyjne
Suszenie fluidyzacyjne
- polega na oddolnym przepuszczeniu przez warstwę granulowanego produktu ogrzanego powietrza o tak dobranej prędkości, że cała suszona masa zostaje uniesiona, tworząc stan „półzawieszony”, czyli fluidalny, w którym produkt zachowuje stałą swobodę ruchów i podlega intensywnemu mieszaniu, co powoduje, że wszystkie jego elementy są równomiernie owiewane czynnikiem suszącym (powietrzem)
Doskonalenie biotechnologicznych cech organizmów
- wyizolowane ze środowisk naturalnych lub pochodzące z kolekcji mikroorganizmy charakteryzują się aktywnością metaboliczną i innymi cechami technologicznymi często niewystarczającymi do zastosowania w procesie produkcyjnym
- celem doskonalenia cech technologicznych drobnoustrojów przemysłowych jest zwiększenie wydajności i produktywności procesu technologicznego, obniżenie kosztów surowcowych, a także podniesienie jakości otrzymanego produktu
Mutageneza
- jednym z podstawowych sposobów doskonalenia drobnoustrojów przemysłowych jest mutageneza i selekcja mutantów o cechach korzystnych dla danego procesu biotechnologicznego
- mutacja jest trwałą zmianą sekwencji DNA prowadząc do powstania zmian genetycznych natomiast mutageneza polega na indukowaniu mutacji w materiale genetycznym danego organizmu
- efektywnośc procesu mutagenezy zależy od rodzaju użytego czynnika, jego stężenia, fazy wzrostu i warunków hodowli drobnoustroju przed poddaniem komórek działaniu mutagenu, skład środowiska w trakcie trwania procesu, a także sprawności mechanizmów naprawczych
- mutageny są to związki chemiczne lub rodzaj promieniowania, które powodują wzrost częstotliwości mutacji w organizmie, często związany ze wzrostem śmiertelności komórek, dlatego też zarówno dawka mutagenu jak i czas jej działania muszą być dokładnie dobrane.
Rekombinacja genetyczna
- jest to proces, w wyniku którego powstają nowe układy genów. Stanowi ona bardziej racjonalny, w porównaniu z mutagenizacją, sposób doskonalenia szczepów przemysłowych.
- Może być ona realizowana dwojako:
- przez hybrydyzację, czyli krzyżowanie szczepów
- przez konstruowanie sztucznych kombinacji genów in vitro i uzyskiwanie ekspresji zaprogramowanej informacji genetycznej w komórkach wybranego gospodarza
Hybrydyzacja
- polega na wymianie odcinków DNA (rekombinacji) między chromosomami lub genoforami dawcy i biorcy w procesie określanym jako crossing – over, wskutek czego można otrzymać rekombinanty o zmienionym genotypie i nowych właściwościach metabolicznych
- obok wydajności określonego metabolitu hybrydyzacja poprawia wiele ważnych cech technologicznych szczepów przemysłowych (szybkość wzrostu, zdolność do przyswajania różnych substratów, tworzenie produktów ubocznych, plon biomasy, właściwości reologiczne hodowli)
Elektroporacja i elektrofuzja
- błona cytoplazmatyczna zapewnia integralność komórki, a jednocześnie jest przenośnikiem substancji i sygnałów metabolicznych między cytoplazmą i środowiskiem
- konsekwencje naruszenia ciągłości błony komórki poddanej impulsowi elektrycznemu są dwojakie:
- elektroporacja: do komórki mogą przeniknąć substancje nieprzechodzące przez błonę natywną
- elektrofuzja: jeżeli impuls stosowany jest w stosunku do komórek ustawionych wzdłuż linii pola i znajdujących się w bliskim kontakcie, może dojść do wymieszania się błon w regionie kontaktu, utworzenia mostka cytoplazmatycznego między różnymi komórkami i wspólnej błony otaczającej cytoplazmy uprzednio oddzielonych komórek, czyli do fuzji komórek
Elesmera