PENICYLINA
Szczepy produkujące penicylinę we współczesnej medycynie – wyselekcjonowane mutanty: panicillium chrysogenum
Pradawne szczepy: kilka mg penicyliny/dm3 roztworu penicyliny
Współczesne szczepy: 50g penicyliny/dm3 roztworu penicyliny
Najlepsi producenci dysponują szczepami (postęp biotechnologiczny), które produkują 100g/ dm3 roztworu penicyliny. Szczepy przechowywane są w formie liofilizowanej lub zamrożonej.
Bioreaktory produkcyjne (fermentatory) – mają objętość do 400cm3. Konstrukcja pochodzi z lat 50 i do tej pory niewiele się zmieniło. Są to reaktory półmechaniczne, działające okresowo. Regulacja temperatury, pH, napowietrzania jest sterowana komputerowo (pełna automatyzacja). Mieszadło pracuje z szybkością 25 – 200 obr/min.
Zachowanie sterylności układu jest bardzo ważne – żeby nie rozwijały się inne mikroorganizmy poza tymi pożądanymi. Powietrze jest sterylizowane metodami termicznymi. Aparatura i pożywki sterylizowane są metodami termicznymi lub chemicznymi.
Pożywki
Zawierają:
- źródła C i energii (sacharoza lub glukoza)
-źródła N (jony amoniowe i NO3-)
- sole nieorganiczne
- wyciągi mięsne lub inne wyciągi
Pożywki są zestalone agarem (wyciąg z alg). To są pożywki na których rozpoczyna się namnażanie szczepów. Później przenosi się je na pożywki ciekłe, w celu dalszego namnażania:
- namok z kukurydzy
- wyciągi lub hydrolizaty mięsne
- hydrolizaty drożdżowe
Podłoża produkcyjne
Surowce:
- mąka sojowa, kukurydziana
- namok kukurydziany
- wyciągi mięsne
- cukry proste zawierające dwucukry: sacharozę i laktozę, monosacharydy: glukozę i sole mineralne
Neutralizator kwasów: węglan wapnia
Pożywki zawierają jeszcze różne dodatki:
- czynniki wzrostu
- prekursory produktu końcowego (np. pochodne kwasu fenylooctowego)
Zagrożenia biologiczne: zakażenie fagami (wirusami bakteryjnymi). Dla ich wykluczenia konieczna jest dezynfekcja i zastosowanie inhibitorów namnażania fagów:
- kwas askorbinowy
- β-propionolaktony
- glutation (najpowszechniej w przyrodzie rozpowszechniony trójpeptyd)
- pewne środki helatujące
Wydzielanie penicyliny
Penicylina może występować w formie wolnego kwasu, który źle rozpuszcza się w wodzie, a dobrze w rozpuszczalnikach organicznych. W wodzie rozpuszcza się sól penicylinowa kwasu, ale stabilność tego wodnego roztworu jest nie duża.
Oczyszczanie penicyliny polega na ekstrakcji wolnego kwasu do rozpuszczalnika organicznego (np. octan butylu) i reekstrakcja do buforu fosforanowego, w której penicylina jest w formie soli (anionu). Operacja ta prowadzona jest kilkakrotnie, a następnie penicylina w formie wodnej zostaje odwodniona, odbarwiona węglem aktywnym, a następnie przez dodatek nasyconego roztworu wodnego octanu sodu lub potasu wytrącona w postaci soli.
Wyodrębnianie antybiotyku/preparatu paszowego
Mikroorganizmy wytwarzające antybiotyki:
Promieniowce (wytwarzają największą liczbę antybiotyków)
Grzyby strzępkowe (nazywane popularnie pleśniami).
Grzyby: organizmy wielokomórkowe, cudzożywne, niektóre żyją w symbiozie, więc są pasożytami. Zalicza się je do plechowców. Komórka ma wyraźne jądro. Ściana komórkowa jest sztywna i gruba zbudowana jest z chityny, glukanu, lipidów i białek. Plecha zbudowana jest z nitkowatych tworów zwanych strzępkami. Strzępki grzybów niższych nie są podzielone i tworzą jedną komórkę. Wyższych są podzielone ściankami i tworzą 2,3 – komórkowe organizmy. Mają stosunkowo małe wymagania żywnościowe i dużą zdolność do przystosowania się do różnych warunków środowiska (mają intensywną przemianę materii – w ciągu 24godz. Potrafią zwiększyć masę 9 – krotnie). Rosną w warunkach tlenowych. Mogą wytwarzać zróżnicowane produkty przemiany materii:
- antybiotyki
- aflatoksyny (silnie kancerogenne)
Rozwijają się w temp. -10 - +55oC.Rozmnażają się przez zarodniki lub płciowo. Pędzlaki z rodzaju penicillium to rodzaj grzybów występujących na owocach (tworzą zielony nalot). Z grzybni wyrastają pionowo wzniesione strzępki, które rozwidlają się wielokrotnie, a na końcach powstają zarodniki (konidia) tworząc łańcuszki nadające kształt pędzelków. Konidia służą do rozmnażania bezpłciowego.
Szczep Fleminga: penicillium notatum
Szczep używany w produkcji penicyliny: penicillium chrysogenum (zdolny do produkcji wgłębnej)
Promieniowce: gram+, mają nieregularną, cylindryczną budowę z tendencją do rozgałęziania. Mogą posiadać pseudogrzybnię powierzchniową, wgłębną lub powierzchniową. Rozmnażają się przez podział, fragmentację pseudogrzybni i tworzenie zarodników pseudokonidialnych oraz przez podział poprzeczny pseudostrzępek.
Powszechnie występują w glebie, kompostach i obornikach, a także na produktach spożywczych. Niektóre gatunki mogą wchodzić w symbiozę z roślinami wyższymi.
Regulacja biosyntezy antybiotyków
1. Represja wywołana przez metabolity
2. Represja i hamowanie kataboliczne
3. Indukcja substratowa
4. Indukcja powierzchni przez efektory metaboliczne
5. Regulacja powierzchni przez związki azotu
6. Regulacja fosforanowa i energetyczna
7. Hamowanie w sprzężeniu zwrotnym
8. Regulacja z udziałem pierwiastków śladowych
9. Regulacja przez inne czynniki tj. temperatura, O2, pH
Represja kataboliczna (przy pomocy źródła C): w obecności glukozy zachodzi szybkie namnażanie komórek i blokada syntezy penicyliny. Problem rozwiązano tak, że początkowo zastosowano mieszaninę glukozy i laktozy jako składnika energetycznego i źródła węgla. Dochodzi wtedy do szybszego wykorzystania glukozy, a następnie powolnego metabolizowania laktozy i wtedy dochodzi do tworzenia penicyliny. Następnie okazało się, że ten sam efekt pojawia się, jeżeli zastosuje się powolne dozowanie glukozy w fazie produkcji antybiotyku.
Wniosek: o produkcji penicyliny nie decyduje rodzaj źródła C, ale tempo jego metabolizowania. Glukoza hamuje syntezę enzymów szlaku biosyntezy antybiotyków.
Mechanizm represji katabolicznej ze strony glukozy lub innych łatwo przyswajalnych źródeł węgla, objawia się przy syntezie wielu innych antybiotyków. Niezależnie stwierdzony inny mechanizm hamowania przez glukozę syntezy enzymów szlaku otrzymywania cefalosporyny C.
Regulacja stężeniem związków azotu: do syntezy penicyliny potrzebne jest źródło azotu. Może to być NH4+, mocznik lub niektóre aminokwasy (L – alanina, kwas L – asparaginowy, L – arginina, L – prolina). W warunkach deficytu białka mogą być to nawet kwasy nukleinowe.
Duże stężenie jonu amonowego hamuje produkcję antybiotyków, ale deficyt tego jonu również hamuje ich syntezę. Dlatego niekiedy do pożywki dodaje się fosforanu magnezowego, ziemi okrzemkowej lub zeolit, które wiążą nadmiar jonów amoniowych, a uwalniają stopniowo w czasie biosyntezy.
Regulacja fosforanowa: jon fosforanowy jest podstawowym składnikiem pożywek. Używany jest w syntezie ufosforyzowanych nukleozydów metabolitów będących efektorami metabolicznymi, które kontrolują różne procesy syntez komórkowych.wzrost następuje w szerokich zakresach: od ułamka, do kilkuset mmoli/l jonu PO43-. Biosynteza antybiotyków wymaga zachowania niewielkiego stężenia jonu, poniżej 10mmol/l, a czasem nawet poniżej 1mmol/l. całkowity brak jonu fosforanowego jest niekorzystne, więc stosuje się zasilanie hodowli tym jonem o bardzo małym stężeniu co zapewnia powolny wzrost organizmów wytwarzających antybiotyk i stymuluje jego syntezę.
Kontrola metaboliczna na zasadzie sprzężenia zwrotnego: końcowy metabolit w nadmiarze blokuje cały szlak metabolizmu inhibując enzym katalizujący pierwszą reakcję szlaku. Np. lizyna hamuje syntezę penicyliny, bo blokuje szlak prowadzący do L – α – aminoadypinianu. Podobnie L – walina i podobna do niej L – leucyna oraz L – izoleucyna, powoduje hamowanie biosyntezy penicyliny.
Penicyliny półsyntetyczne
Rozkład tego wiązania:
enzymy: acylazy penicylinowe rozpad układu β – laktamowego
enzymy: β – laktamazy
(niekorzystne, powodują neutralizację, antybiotyk staje się nieskuteczny)
kwas 6AP
Penicylina V
W 1948 roku stwierdzono, że jeżeli w środowisku pojawi się zamiast kwasy fenylooctowego, kwas fenoksyoctowy to można uzyskać penicylinę V:
Ma lepsze właściwości niż penicylina G, można ją stosować doustnie (penicylinę G należy stosować iniekcyjnie). Penicylina G i V są wspólnie produkowane metodami biotechnologicznymi. Inne penicyliny są produkowane w ten sposób, że wychodzi się z penicyliny G lub V, przekształca ją do kwasu 6AP i jest to substrat wyjściowy do produkcji innych modyfikowanych penicylin.
Półsyntetyczne penicyliny są produkowane aby:
- zwiększyć aktywność
- poszerzyć spektrum działania
- przedłużyć czas działania
- zwiększyć stabilność chemiczną
- poprawić właściwości fizyko – chemiczne (rozpuszczalność, wchłanialność, smak)
- zmniejszyć toksyczność i występowania reakcji alergicznych
- poprawić odporność na dezaktywację enzymatyczną
- zwiększyć odporność na środowisko kwaśne
Metoda chemiczna: podstawową operacją w metodach otrzymywania półsyntetycznych penicylin jest arylowanie kwasu 6AP chlorkami kwasowymi lub bezwodnikami mieszanymi.
Pierwsza pochodną wprowadzoną do lecznictwa była metacylina, która należy do penicylin 3 generacji (jest 6 generacji). Tylko około 30 penicylin weszło do lecznictwa – mniej niż 0,1%.
Cefalosporyna C wykryta u:
- cephalosporium chrysogenium
CEFEPIM (cefalosporyna IV generacji) odkryta w 1993 roku, jest używana w leczeniu ciężkich i powikłanych zakażeń, pasocznic, zakażeń bakteriami wieloodpornymi, w tym zakażeń wewnątrzszpitalnych. Ma:
- bardzo szeroki zakres działania
- poprawione właściwości farmakokinetyczne
- działa na bakterie zarówno G+ i G-
- działa na penicylino odporne szczepy Streptococcus pneumonie
-odporna na działanie β – laktamaz chromosomalnych i plazmidowych
Otrzymywanie kwasu 6AP (hydroliza penicyliny)
Penicylina G lub V
acylaza penicylinowa R3SiCl
PCl5
H+/H2O
R1OH
Droga biotechnologiczna: r. odwracalna. Enzymy katalizujące tą reakcję, katalizują również reakcję odwrotną. Reakcja ta może być wykorzystana do wytwarzania innych modyfikowanych penicylin, ale są one przeważnie otrzymywanie na drodze chemicznej. W środowisku obojętnym (pH 7,5 – 8,5) enzymy te hydrolizują penicylinę G lub V, natomiast w środowisku kwaśnym mogą służyć do biosyntezy nowych pochodnych penicylin.
Źródła enzymu użytego na drodze biotechnologicznej (wyselekcjonowane szczepy bakterii):
- achromobacter spp. Alcaligens faecalis
- escherichia coli
- baccilium megaterium
- proteusz rettgeri
- pseudomonas melanogenes
- drożdże z gatunku klunyvera citropila
Można posługiwać się całymi komórkami lub wyizolowanymi enzymami. W praktyce lepiej izolować enzymy, ponieważ niektóre komórki mogą wydzielać laktamazy. Enzymy wyizolowane poddawane są immobilizacji.
Udoskonalenie enzymów:
- selekcja
- mutageneza
- klonowanie rekombinowanych plazmidów
- przeniesienie genu acylazy do nowego gospodarza
W produkcji wykorzystywane są rekombinowane szczepy E. coli zawierające zwielokrotnioną liczbę (kopii genu) acylazy penicylinowej.
Biosynteza enzymu: trwa kilkanaście godzin równolegle do narastania biomasy. Temp. poniżej 30oC, pH=6,5 – 8. Gdy pH osiąga 8 to biosynteza jest przerywana.
Wydzielanie enzymu
ludi.lg