sprawozdanie_z_ćwicz.odt

Sprawozdanie z ćwiczeń z Ekotoksykologii w dn. 21.01.2012

Barbara Malinowska, Michał Uchman, Damian Smoleń, Marek Jodłowski,

Badanie wrażliwości drożdży Saccharomyces cerevisiae na pochodne chinonowe.

Cel ćwiczeń:

Określenie toksyczności menadionu względem komórek drożdży  Saccharomyces cerevisiae SP4 (WT), zbadanie roli dysmutazy ponadtlenkowej w ochronie drożdży przed stresem oksydacyjnym wywołanym pochodnymi chinonowymi.

1.  Materiał, sprzęt, odczynniki

✔       

✔      hodowle logarytmiczne szczepów drożdży:

SP4 (szczep dziki)

✔      mikroskop

✔      szalki Petriego z podłożem YPG

✔      komora Melassez, głaszczki, pipety automatyczne, zlewki, probówki Eppendorfa (1,5 ml)

✔      100 mM roztwór menadionu w alkoholu etylowym

✔      alkohol etylowy

✔      woda destylowana

2.   Wykonanie

Ćwiczenie przeprowadzano w warunkach sterylnych.

●                     za pomocą komory Melassez sprawdzono gęstość otrzymanych logarytmicznych hodowli drożdży

Policzono komórki drożdży w 5 kwadratach, a następnie wyciągnięto średnią z wyników.

Średnia liczba komórek SP4 – 5,8

Obliczono gęstość hodowli drożdży:

g = śr. l. komórek x 100 x 1000 x rozcieńczenia

g = 5,8 * 100 * 1000 *100

g =  5,8 x 109

●                      

●                              metodą seryjnych rozcieńczeń uzyskano zawiesinę komórek o gęstości 5,8 x 107 kom./ml.

•                      Pobrano do probówki:

•                      0,1 ml hodowli drożdży oraz dodano 0,9 ml H2O – uzyskano roztwór 5,8 x 108

•                      następnie z uzyskanego roztworu pobrano ponownie 0,1ml i dodano 0,9 ml H2O – uzyskano rozcieńczenie 5,8 x 107

●                     przygotowano rozcieńczenia wyjściowego roztworu menadionu (100 mM) w etanolu aby uzyskać stężenia: 50, 25, 10 mM

Metoda obliczeń:

●                     na każdą z 5 szalek Petriego  z podłożem YPG napipetowano po 100 μl zawiesiny komórek drożdży o gęstości 2 x 107 kom./ml. i głaszczkami rozprowadzono dokładnie po całej powierzchni

●                     na środek 4 szalek nakropiono po 5 μl kolejnych roztworów menadionu: 100, 50, 25, 10 mM. Na szalce traktowanej jako próba kontrolna nakropiono 5 μl etanolu

●                     po wyschnięciu kropel wstawiono szalki do cieplarki (28 C°) na okres 2 dni

●                     po upływie 48 h  ma każdej szalce zmierzono linijką (w 4 płaszczyznach) średnicę stref zahamowania wzrostu

3.                  Wyniki

Zestawienie średnich wartości średnic stref zahamowania wzrostu dla poszczególnych stężeń

Stężenie menadionu w mg/l:

1 mol menadionu = 172, 2 g

0,1 mol = x

x = 17,22 g = 17220 mg

17220/2 = 8610

8610/2 = 4305

17220/10 = 1722

Obliczono % śmiertelności przyjmując za 100% średnicę szalki Petriego – 94mm z proporcji

94mm – 100%

13mm - x

Określenie LC i obliczenie LC50 metodą probitową i metodą graficznej interpolacji

a) Dane pomocnicze do wyliczenia współczynnika regresji b