Inwertazy roslinne.pdf

PRACE PRZEGL¥DOWE

Inwertazy roœlinne – funkcja

fizjologiczna, regulacja aktywnoœci

oraz wykorzystanie w biotechnologii

Barbara Hawrylak 1 , Barbara Wolska-Mitaszko 2

1 Wydzia³ Ogrodniczy, Akademia Rolnicza, Lublin

2 Instytut Mikrobiologii i Biotechnologii, Uniwersytet Marii Curie-

-Sk³odowskiej, Lublin

Plant invertases – physiological function, regulation of activity and

application in biotechnology

Summary

Disaccharide sucrose plays important role in plants in photoassimilate par-

titioning, and as a carbon and energy source, it regulates cell metabolism, plant

growth and development. Utilization of sucrose in most metabolic pathways is

preceding by enzymatic cleavage of sucrose to monosaccharides. This cleavage

is catalyzed by invertase and sucrose synthase. Hydrolysis of sucrose to glucose

and fructose provides substrates to primary metabolism reactions proceed in

plant cell. Because sugars in plants are not only nutrients molecules, but also

regulate expression of genes, invertase can control cell division and plant devel-

opment. Several types of invertases can exist in plant cells, which differ in their

biochemical properties and cell localization. The rapid accumulation of informa-

tion about their physiological function and regulation in planta has revealed the

biotechnological potential of these proteins. This review focuses on recent ad-

vances in the properties and role of the identified plant invertases in the light of

application for plant metabolic engineering.

Adres do korespondencji

Barbara Hawrylak,

Katedra Fizjologii Roœlin,

Akademia Rolnicza,

ul. Akademicka 15,

20-950 Lublin.

Key words:

invertase, sucrose metabolism, assimilates distribution, sugar sensing, bio-

technological applications.

1. Wstêp

U roœlin wy¿szych powstaj¹ce w procesie fotosyntezy wêglo-

wodany transportowane s¹ z organów donorowych (ang. source )

do organów akceptorowych (ang. sink ) najczêœciej w formie sa-

2 (77) 63–80 2007

Barbara Hawrylak, Barbara Wolska-Mitaszko

charozy. Cukier ten nieprzypadkowo wyselekcjonowany zosta³ w procesie ewolucji

jako g³ówna forma transportu wêglowodanów w roœlinach. Jest stabilnym zwi¹z-

kiem nieredukuj¹cym i nie nara¿a tkanek na ró¿nego rodzaju reakcje oksydoreduk-

cyjne w czasie przemieszczania w roœlinie. Produkty hydrolizy sacharozy s¹ g³ów-

nym substratem oddechowym oraz uczestnicz¹ w procesach osmoregulacji w ko-

mórkach roœlinnych (1). Na podstawie badañ prowadzonych w ostatnich latach do-

starczono licznych dowodów na udzia³ cukrów, zw³aszcza sacharozy i produktów

jej rozpadu, w regulacji metabolizmu roœlin (2,3). Dostarczaj¹c informacji o stopniu

zaopatrzenia oraz zapotrzebowania komórek na produkty fotosyntezy, cukry pe³ni¹

funkcjê substancji sygna³owych i wp³ywaj¹ na ekspresjê wielu klas genów zaanga-

¿owanych w metabolizm wêglowodanów oraz procesy rozwojowe roœlin (4-6). Sa-

charoza mo¿e byæ wykorzystywana w metabolizmie komórkowym na drodze dwóch

przemian. Nieodwracalna hydroliza sacharozy jest katalizowana przez inwertazê

[EC 3.2.1.26] (sacharoza + H 2 O glukoza + fruktoza). Natomiast syntaza sacharo-

zy [EC 2.4.1.13], bior¹ca tak¿e udzia³ w syntezie tego dwucukru, przeprowadza od-

wracaln¹ reakcjê z udzia³em UDP (sacharoza + UDP UDP-glukoza + fruktoza).

W roœlinach inwertaza jest podstawowym enzymem bior¹cym udzia³ w mobilizacji

i degradacji sacharozy podczas ca³ego cyklu ¿yciowego, jak równie¿ w odpowiedzi

roœlin na czynniki œrodowiskowe, poniewa¿ zarówno substraty jak i produkty katali-

zowanej przez ten enzym reakcji s¹ jednoczeœnie cz¹steczkami sygna³owymi (7,8).

2. Klasyfikacja i charakterystyka inwertaz

Inwertazy stanowi¹ rodzinê enzymów, których wystêpowanie stwierdzono

u wielu gatunków roœlin wy¿szych, a liczne oczyszczono i scharakteryzowano na po-

ziomie molekularnym. Na podstawie optimum pH inwertazy mo¿na podzieliæ na

kwaœne oraz neutralne lub alkaliczne. Natomiast bior¹c pod uwagê lokalizacjê ko-

mórkow¹, punkt izoelektryczny, optimum pH oraz rozpuszczalnoœæ powszechnie

wyró¿nia siê trzy typy inwertaz: 1) inwertazy wakuolarne (Inv-V) – kwaœne, roz-

puszczalne inwertazy wystêpuj¹ce w wakuoli; 2) inwertazy zwi¹zane ze œcian¹ ko-

mórkow¹ (Inv-CW) – kwaœne, nierozpuszczalne inwertazy zwi¹zane jonowo ze œcia-

n¹ komórkow¹; 3) inwertazy neutralne (Inv-N) – neutralne/alkaliczne, rozpuszczal-

ne inwertazy wystêpuj¹ce w cytoplazmie (8,9). W tabeli zebrano informacje na te-

mat podstawowych w³aœciwoœci inwertaz.

Ka¿dy z trzech typów inwertaz reprezentowany jest przez ró¿ne izoenzymy. Po-

szczególne izoformy ró¿ni¹ siê niektórymi w³aœciwoœciami biochemicznymi, np. wra¿-

liwoœci¹ na inhibitory. W komórkach roœlinnych wystêpuj¹ przynajmniej 2 izoformy

Inv-V oraz 6 izoform Inv-CW (8). Znane s¹ równie¿ 2 izoformy Inv-N, która jest do-

tychczas najs³abiej scharakteryzowanym typem inwertazy (10,11). Fizjologiczna ko-

rzyœæ z wystêpowania izoenzymów polega na wiêkszej elastycznoœci i efektywnoœci

kontroli transportu, dystrybucji oraz magazynowania sacharozy w odpowiedzi na

PRACE PRZEGL¥DOWE

Inwertazy roœlinne – funkcja fizjologiczna, regulacja aktywnoœci oraz wykorzystanie w biotechnologii

czynniki œrodowiskowe oraz na etapie ró¿nych stadiów rozwojowych tkanek i orga-

nów roœlinnych (12).

Tabela

W³aœciwoœci ró¿nych typów inwertaz roœlinnych

Typ inwertazy

Optimum pH

Lokalizacja Rozpuszczalnoœæ Glikozylacja

inwertaza wakuolarna

Inv-V

kwaœne

pH 5,0-5,5

obojêtny

wakuola

nierozpuszczalna

inwertaza œciany komórkowej

Inv-CW

kwaœne

pH 3,5-5,0

zasadowy/kwaœny apoplast

rozpuszczalna

inwertaza neutralna

Inv-N

obojêtne lub zasadowe

pH 6,8-8,0

obojêtny

cytoplazma rozpuszczalna

–-

Poszczególne izoformy s¹ prawdopodobnie kodowane przez ró¿ne geny (9,10).

Geny koduj¹ce inwertazy kwaœne (Inv-V oraz Inv-CW) wyizolowano ju¿ z kilku ga-

tunków roœlin: pomidora, rzodkiewnika, kukurydzy, marchwi (10), ¿ycicy (13) i ziem-

niaka (14). Na podstawie mapowania genów inwertaz kwaœnych pochodz¹cych

z rzodkiewnika, pomidora i kukurydzy wykazano, ¿e w ka¿dej z tych roœlin s¹ one

zlokalizowane na ró¿nych chromosomach. Jednak pomiêdzy gatunkami roœlin jed-

no- i dwuliœciennych stwierdza siê znaczny stopieñ konserwatywnoœci, je¿eli chodzi

o ich strukturê. Wyizolowane do tej pory geny inwertaz kwaœnych zawieraj¹ od sze-

œciu do oœmiu eksonów. Z regu³y we wszystkich tych genach wystêpuje ekstremal-

nie ma³y ekson (ekson II), sk³adaj¹cy siê tylko z 9 nukleotydów. Jest to jeden z naj-

mniejszych eksonów wystêpuj¹cych u roœlin wy¿szych. Koduje on tripeptyd (DPN),

tworz¹cy rdzeniow¹ czêœæ konserwatywnego motywu

-fruktofuranozydazy

(NDPNG) (8-10).

U rzodkiewnika zidentyfikowano dotychczas 6 genów koduj¹cych Inv-CW (geny

AtcwINV ), z których piêæ ulega ekspresji w rozwijaj¹cych siê nasionach, przy czym

ekspresja czterech z nich jest najbardziej intensywna w fazie ró¿nicowania komórek

(15). W roœlinach ziemniaka zidentyfikowano 2 geny koduj¹ce Inv-CW ( invCD111

i invCD141 ), które ulega³y specyficznej ekspresji w tkankach floemu (14). Ekspresja

genów koduj¹cych Inv-V w roœlinach ¿ycicy ( Inv 1:2 i Inv 1:4 ) jest równie¿ specyficzna

tkankowo: ekspresja Inv 1:2 zachodzi g³ównie w korzeniach, natomiast Inv 1:4 prze-

wa¿nie w liœciach (13). Dlatego te¿ sugeruje siê, ¿e roœliny podczas ewolucji wy-

kszta³ci³y niewielk¹ rodzinê genów inwertaz kwaœnych, których ekspresja zachodzi

niezale¿nie, w specyficznym miejscu i czasie podczas rozwoju roœliny (10).

Przypuszcza siê, ¿e sekwencje genowe koduj¹ce poszczególne izoformy inwer-

taz kwaœnych powsta³y w wyniku odleg³ej w czasie, przypadkowej duplikacji genu.

W ostatnich badaniach dotycz¹cych filogenetycznych relacji pomiêdzy genami ko-

duj¹cymi Inv-CW oraz Inv-V wykazano, ¿e Inv-V prawdopodobnie ewoluowa³a

z Inv-CW w wyniku mutacji, która wywo³a³a zmianê sekwencji sygna³owej i zadecy-

BIOTECHNOLOGIA 2 (77) 63-80 2007

Barbara Hawrylak, Barbara Wolska-Mitaszko

dowa³a o skierowaniu bia³ka do wakuoli (16). Uzyskane w nielicznych przypadkach

sekwencje cDNA koduj¹cego Inv-N nie wykazuj¹ podobieñstwa do sekwencji inwer-

taz kwaœnych, s¹ natomiast w znacznym stopniu homologiczne z genami inwertaz

bakterii fotosyntetyzuj¹cych (17). W komórkach cyjanobakterii zidentyfikowano

dwa geny ( inv Ai inv B), które wykazywa³y 50-56% homologiê z roœlinnym genem ko-

duj¹cym bia³ko Inv-N o masie cz¹steczkowej 53-55 kDa. Poniewa¿ Inv-N wystêpuje

tylko w komórkach roœlin i cyjanobakterii, przypuszcza siê, ¿e geny roœlinnej Inv-N

wywodz¹ siê z ortologicznego genu organizmu prokariotycznego, który wnikn¹³ do

komórki roœlinnej na drodze endosymbiozy (18).

Z uwagi na podobieñstwo sekwencji genowych inwertaz kwaœnych kodowane

przez nie bia³ka charakteryzuj¹ siê podobn¹ budow¹ oraz w³aœciwoœciami bioche-

micznymi. Inv-CW oraz Inv-V syntetyzowane s¹ jako prepropeptydy. Porównanie se-

kwencji aminokwasowych tych enzymów wykaza³o obecnoœæ N-koñcowej domeny,

zawieraj¹cej do 100 reszt aminokwasowych, która jest odcinana podczas transportu

i dojrzewania bia³ka (10,19). Przypuszczalnie jest ona podzielona na 2 segmenty:

peptyd sygna³owy (niezbêdny przy wprowadzaniu bia³ka do retikulum endoplazma-

tycznego i szlaku wydzielniczego) oraz N-koñcowy propeptyd (rys. 1). W przeciwieñ-

stwie do Inv-CW, prepropeptyd Inv-V zawiera dodatkowo krótk¹ domenê aminokwa-

sow¹ do³¹czon¹ do koñca C, która mo¿e braæ udzia³ w kierowaniu bia³ka do wakuoli

(9,10). Wspóln¹ cech¹ dojrza³ych bia³ek inwertaz kwaœnych jest obecnoœæ pentapep-

tydu NDPNG tworz¹cego konserwatywny motyw -fruktofuranozydazy, który wystê-

puje tak¿e w inwertazach bakteryjnych i dro¿d¿owych (8). Mimo ¿e sekwencja ami-

nokwasowa Inv-CW i Inv-V jest homologiczna w ok. 40-60%, enzymy te ró¿ni¹ siê nie-

znacznie optimum pH oraz specyficznoœci¹ substratow¹. W badaniach nad w³aœciwoœ-

ciami Inv-V i Inv-CW (20), pochodz¹cymi z tych samych gatunków roœlin, wykazano,

¿e chocia¿ oba typy enzymu posiadaj¹ kwaœne optimum pH, to dla Inv-V jest ono

z regu³y oko³o 0,6-0,9 jednostki wy¿sze w porównaniu z Inv-CW. Ponadto specyficz-

noœæ Inv-V w stosunku do rafinozy jest 16-30% ni¿sza ni¿ Inv-CW. Ró¿nice te wy-

wo³ywane s¹ pojedyncz¹ substytucj¹ w sekwencji aminokwasowej obu enzymów.

W konserwatywnej sekwencji (WEC-P/V-DF) Inv-V obecna jest walina, natomiast

w tym samym miejscu w Inv-CW stwierdzono wystêpowanie proliny (20).

Inwertazy kwaœne, w przeciwieñstwie do Inv-N, ulegaj¹ procesowi N-glikozylacji

(9). Glikozylacja Inv-CW jest niezbêdna do efektywnego transportu przez b³onê pla-

zmatyczn¹, niezale¿nie od struktury do³¹czonego do N-koñca oligosacharadu.

Stwierdzono, ¿e pozbawiona reszty cukrowej Inv-CW ulega szybkiej degradacji

w aparacie Golgiego. Natomiast w przypadku Inv-V, ta potranslacyjna modyfikacja,

prawdopodobnie nie pe³ni specyficznej roli podczas kierowania bia³ka do wakuoli

(21). Masa cz¹steczkowa kwaœnych inwertaz waha siê w doœæ szerokim zakresie (od

50 kDa do 450 kDa), gdy¿ w natywnej formie mog¹ one wystêpowaæ w postaci mo-

nomerów, dimerów lub oligomerów (12). Ponadto aktywnoœæ tych enzymów hamuj¹

czynniki blokuj¹ce grupy sulfhydrylowe, co przypuszczalnie zwi¹zane jest z obecnoœ-

ci¹ reszty cysteiny w ich centrum aktywnym (8).

PRACE PRZEGL¥DOWE

Inwertazy roœlinne – funkcja fizjologiczna, regulacja aktywnoœci oraz wykorzystanie w biotechnologii

Rys. 1. Schemat struktury pierwszorzêdowej inwertaz kwaœnych (wg 9, 10, zmodyfikowane).

Trudnoœci napotykane podczas badañ w³aœciwoœci biochemicznych Inv-N wyni-

kaj¹ ze znacznej niestabilnoœci tego enzymu i szybkiej utraty jego aktywnoœci pod-

czas homogenizacji tkanek. Jedynie w nielicznych przypadkach uda³o siê otrzymaæ

oczyszczone bia³ka enzymatyczne, których optimum pH waha siê w zakresie

pH 6,8-8,0 (8,10). Z wyj¹tkiem Inv-N pochodz¹cej z marchwi (22), w natywnej formie

wystêpuj¹ one z regu³y jako homotetramery z³o¿one z podjednostek o masie

54-65 kDa. Ich aktywnoœæ jest gwa³townie hamowana w obecnoœci glukozy i frukto-

zy, ale nie pod wp³ywem jonów metali, co wskazuje na znaczne ró¿nice w budowie

centrum aktywnego neutralnych i kwaœnych inwertaz (10). Ponadto sekwencja ami-

nokwasowa Inv-N jest bogata w cysteinê i zdecydowanie ró¿ni siê od inwertaz kwaœ-

nych. Wystêpowanie homologicznej struktury pierwszorzêdowej do roœlinnej Inv-N

stwierdzono jedynie u bakterii fotosyntetyzuj¹cych (17,23).

Wykazano, ¿e inwertazy o kwaœnym optimum pH mog¹ hydrolizowaæ, oprócz sa-

charozy, równie¿ inne dwucukry, które posiadaj¹ koñcow¹, niepodstawion¹ resztê

-D-fruktofurazynow¹ jak np. rafinoza czy stachioza. Jednak aktywnoœæ enzymatycz-

na w stosunku do tych wêglowodanów jest znacznie ni¿sza w porównaniu z w³aœci-

wym substratem, jakim jest sacharoza. Natomiast Inv-N jest najprawdopodobniej

aktywna specyficznie jedynie w stosunku do sacharozy (19). Inwertazy kwaœne mo-

g¹ równie¿ uczestniczyæ w syntezie fruktanów, które przechowywane s¹ w wakuoli

komórek wielu gatunków traw i innych roœlin, stanowi¹c zapas wêglowodanów (13).

Podczas biosyntezy fruktanów pierwszy etap obejmuje m. in. powstawanie 1-keto-

zy, a niektóre inwertazy wykazuj¹ aktywnoœæ glukotransferazy i katalizuj¹ syntezê

trisacharydów, najczêœciej 1-ketozowych (24). Na podstawie pewnych danych do-

œwiadczalnych wskazuje siê jednak, ¿e aktywnoœæ Inv-V u traw spada podczas bio-

syntezy fruktanów, natomiast wzrasta w procesie ich rozk³adu (13).

BIOTECHNOLOGIA 2 (77) 63-80 2007

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: