ENZYMY. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH.pdf

Ę wiczenie 7

ENZYMY. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Cz ħĻę do Ļ wiadczalna obejmuje:

− wyznaczenie optimum pH dla reakcji katalizowanej przez kwa Ļ n Ģ fosfataz ħ

− wyznaczenie szybko Ļ ci pocz Ģ tkowej reakcji katalizowanej przez kwa Ļ n Ģ fosfataz ħ

WPROWADZENIE

Fosfataza kwa Ļ na (EC 3.1.3.2) – „enzym znacznikowy” lizosomów, głównego miejsca

trawienia wewn Ģ trzkomórkowego

Fosfatazy to grupa enzymów nale ŇĢ cych do klasy hydrolaz (klasa 3 – obejmuje en-

zymy rozszczepiaj Ģ ce wi Ģ zania z udziałem cz Ģ steczki wody, Tabela 1), podklasy enzymów

hydrolizuj Ģ cych wi Ģ zania estrowe (esterazy), podpodklasy hydrolaz monoestrów fosforano-

wych.

Tabela 1. Klasy enzymów (Koolman i Röhm 2005)

Fosfatazy katalizuj Ģ odszczepienie reszty fosforanowej od cukrowców, białek, tłuszczowców,

nukleotydów i wielu innych naturalnych estrów kwasu fosforowego według poni Ň szej reakcji:

R-O-PO 3 H¯ + H 2 O R-OH + H 2 PO 4 ¯

Poza naturalnymi substratami, hydrolazy monoestrów fosforanowych rozszczepiaj Ģ tak Ň e

estry fosforanowe fenoli, np. p-nitrofenylofosforan.

Fosfatazy działaj Ģ w pH alkalicznym, z optymalnym pH w zakresie 9,0 – 11,0, jak

równie Ň w pH kwa Ļ nym i oboj ħ tnym, w zakresie 4,5 – 7,0. Te ostatnie s Ģ typowe dla komórek

ro Ļ linnych, chocia Ň nie brakuje ich tak Ň e w komórkach zwierz ħ cych, gdzie wyst ħ puj Ģ przede

wszystkim w lizosomach , niewielkich błonowych p ħ cherzykach b ħ d Ģ cych głównym miej-

scem trawienia wewn Ģ trzkomórkowego . Lizosomy zawieraj Ģ specyficzny zestaw hydrolaz,

optymalnie aktywnych w Ļ rodowisku kwa Ļ nym, uczestnicz Ģ cych w rozkładzie organelli ko-

mórkowych i wszystkich rodzajów makrocz Ģ steczek dostarczanych do komórki ró Ň nymi dro-

gami. Wiod Ģ cym enzymem jest tu kwa Ļ na fosfataza uznawana za tzw. „enzym znaczniko-

wy” lizosomów . Kwa Ļ ne Ļ rodowisko Ļ wiatła lizosomu (pH ~ 5) jest utrzymywane dzi ħ ki

działaniu błonowej H + -ATPazy, pompuj Ģ cej H + z cytozolu do wn ħ trza lizosomu (Ryc. 1).

Ryc. 1 . Schemat lizosomu (Alberts i wsp. 1999)

W oboj ħ tnym pH cytoplazmy (pH 7 – 7,3), hydrolityczne enzymy lizosomalne wykazuj Ģ ni-

sk Ģ aktywno Ļę . Jest to przypuszczalnie mechanizm obronny przed samoistnym strawieniem

fosfataza

komórki, w przypadku, gdyby enzymy dostały si ħ do cytoplazmy. W komórkach ro Ļ lin i

grzybów rol ħ lizosomów pełni wakuola komórkowa . Kwa Ļ ny odczyn wn ħ trza wakuoli, istot-

ny dla aktywno Ļ ci wyst ħ puj Ģ cych tam enzymów hydrolitycznych, jest utrzymywany dzi ħ ki

działaniu dwóch pomp protonowych (H + -ATPazy i H + -PPazy) zlokalizowanych w błonie ota-

czaj Ģ cej wakuol ħ , tzw. tonopla Ļ cie.

Podstawy kinetyki enzymatycznej

Kinetyka enzymatyczna stanowi dział enzymologii zajmuj Ģ cy si ħ zagadnieniami zwi Ģ -

zanymi z szybko Ļ ci Ģ reakcji katalizowanych enzymatycznie. Szybko Ļę reakcji enzymatycz-

nej (V), która jest miar Ģ aktywno Ļ ci , czyli katalitycznego działania enzymu, mierzy si ħ

podobnie jak szybko Ļę reakcji chemicznych. Jest ona w pewnym zakresie proporcjonalna do

st ħŇ enia substancji reaguj Ģ cych; wyznacza j Ģ przyrost st ħŇ enia produktu reakcji w czasie .

Miar Ģ szybko Ļ ci reakcji w danym momencie jest wi ħ c wzrost st ħŇ enia produktu, jaki nast ħ pu-

je w jednostce czasu.

Aktywno Ļę enzymatyczn Ģ wyra Ň amy w dwóch standardowych jednostkach. S Ģ to:

jednostka enzymatyczna (U) oraz katal (kat) . Jednostka enzymatyczna ( U ) jest to taka

ilo Ļę enzymu, która katalizuje przekształcenie 1 µmola substratu w ci Ģ gu 1 minuty, w warun-

kach optymalnych dla danego enzymu. Katal (kat) jest jednostk Ģ aktywno Ļ ci enzymatycznej

obowi Ģ zuj Ģ c Ģ w układzie SI i jest definiowany jako aktywno Ļę katalityczna, która zwi ħ ksza

szybko Ļę reakcji o 1 mol na sekund ħ , w warunkach optymalnych.

Przy stałym st ħŇ eniu enzymu i substratu szybko Ļę powstawania produktu reakcji powinna by ę

wprost proporcjonalna do czasu reakcji. W rzeczywisto Ļ ci tylko w pocz Ģ tkowej fazie reakcja

ta jest reakcj Ģ pierwszego rz ħ du (Ryc. 2), co znaczy, Ň e szybko Ļę działania enzymu jest li-

niow Ģ funkcj Ģ czasu – jest to tzw . szybko Ļę pocz Ģ tkowa reakcji enzymatycznej (V 0 ) .

Ryc. 2. Wzrost ilo Ļ ci produktu reakcji enzymatycznej w czasie

Nale Ň y pami ħ ta ę , Ň e w analizach in vitro st ħŇ enie substratu maleje w czasie reakcji i przy

dłu Ň szym czasie inkubacji zale Ň no Ļę pomi ħ dzy przyrostem produktu, a czasem reakcji nie

b ħ dzie funkcj Ģ liniow Ģ (Ryc. 2). Równie Ň enzym w trakcie wykonywania oznacze ı mo Ň e

ulega ę denaturacji, co pogł ħ bia powy Ň szy efekt. Warto Ļę V 0 uzyskuje si ħ przez wykre Ļ lenie

linii prostej stycznej do pocz Ģ tkowego odcinka krzywej, poczynaj Ģ c od czasu zerowego

(Ryc. 2). Nachylenie tej prostej ma warto Ļę V 0 . Dla bada ı kinetyki enzymów in vitro niezwy-

kle wa Ň ne jest wi ħ c okre Ļ lenie czasu reakcji, w którym przyrost produktu reakcji enzyma-

tycznej jest wprost proporcjonalny do czasu.

V 0 =

Szybko Ļę reakcji enzymatycznej zale Ň y od wielu czynników fizycznych i chemicznych, ta-

kich jak: st ħŇ enie enzymu, st ħŇ enie substratu, temperatura, pH, st ħŇ enie aktywatorów i inhibi-

torów. Wi ħ kszo Ļę enzymów wykazuje maksymaln Ģ aktywno Ļę w Ļ rodowisku o okre Ļ lonym

st ħŇ eniu jonów wodorowych (w okre Ļ lonym pH). Wynika to st Ģ d, Ň e w katalizie enzymatycz-

nej bior Ģ udział, mi ħ dzy innymi, zjonizowane grupy funkcyjne centrum aktywnego. Odsetek

cz Ģ steczek enzymu, w których grupy kwasowe lub zasadowe znajduj Ģ si ħ w formie jonowej,

zale Ň y od pK tych grup i st ħŇ enia jonów wodorowych w roztworze. Zale Ň no Ļę aktywno Ļ ci

enzymatycznej od pH przyjmuje najcz ħĻ ciej posta ę krzywej w kształcie dzwonu (Ryc. 3).

Ryc. 3. Zale Ň no Ļę aktywno Ļ ci enzymu od pH (Koolman i Röhm 2005)

produkt (µmole)

czas (min)

Rozpi ħ to Ļę optimum pH , czyli takiej warto Ļę pH, przy której aktywno Ļę jest maksymalna,

jest bardzo du Ň a. Dla wielu enzymów optimum pH znajduje si ħ w pobli Ň u pH komórki (pH

7,0), ale np. pepsyna (EC 3.4.23.1) wyst ħ puj Ģ ca w kwa Ļ nym Ļ rodowisku Ň oł Ģ dka wykazuje

najwy Ň sz Ģ aktywno Ļę w pH około 2,0, a arginaza (EC 3.5.3.1.) w pH powy Ň ej 10,0. Optymal-

n Ģ warto Ļę pH, która jest jedn Ģ z warto Ļ ci liczbowych charakteryzuj Ģ cych dany enzym, wy-

znacza si ħ z wykresu zale Ň no Ļ ci aktywno Ļ ci od pH .

WYKONANIE

Zasada metody

W ę wiczeniu, do wyznaczenia optimum pH, podobnie jak w wyznaczaniu szybko Ļ ci

pocz Ģ tkowej reakcji, stosuje si ħ metod ħ , w której naturalny substrat kwa Ļ nej fosfatazy zo-

staje zast Ģ piony sztucznym substratem – p -nitrofenylofosforanem (analogiem naturalnego

substratu). Enzym hydrolizuj Ģ c p -nitrofenylofosforan, uwalnia p -nitrofenol , który w Ļ rodowi-

sku zasadowym tworzy Ň ółto zabarwiony anion p -nitrofenolanowy .

fosfataza

O N

p -nitrofenylofosforan (pNPP) p -nitrofenol (pNP)

Nat ħŇ enie barwy mierzone przy l = 405 nm jest proporcjonalne do ilo Ļ ci zhydrolizowanego

substratu. Ryc. 4 przedstawia widmo absorpcyjne p -nitrofenylofosforanu (pNPP) i p -

nitrofenolu (pNP).

Ryc. 4. Widmo absorpcyjne pNPP i

pNP w Ļ rodowisku alkalicznym

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: