Kto_pod_kim_dolki_kopie.pdf

Kto pod kim dołki kopie - o antybiotykach i antybiotykooporności

Marcin Kłak

Zaprezentowany artykuł jest krótkim przeglądem mechanizmów działania antybiotyków oraz mechanizmów

antybiotykooporności. Zawarto w nim podstawowe informacje na temat procesów zakłócanych przez tę grupę leków. W

pierwszej części omówiono czym są antybiotyki oraz na czym polega antybiotykooporność. Druga część zawiera zaś

opracowanie działania kilku najważniejszych grup antybiotyków wraz ze wskazanymi mechanizmami oporności jakie

znaleziono u bakterii.

Antybiotyki, czym są i jak je dzielimy

Choć każdy z nas zetknął się z antybiotykami, to jednak tak naprawdę zwykły człowiek mało wie o tej interesującej

grupie leków. Samo zdefiniowanie pojęcia antybiotyku nie jest wcale proste. Różni badacze inaczej rozumieją to pojęcie i

podczas, gdy jedni trzymają się dawnej definicji, inni są zwolennikami rozszerzenia tego pojęcia. Dawniej uważano, że

antybiotyk, to substancja chemiczna produkowana przez pewne drobnoustroje i mająca negatywny wpływ na wzrost i

rozwój innych mikroorganizmów. Obecnie, pojęcie to poszerzane jest także o związki półsyntetyczne wyprowadzone z

naturalnych produktów, a także o związki syntetyczne wzorowane na tych produkowanych przez mikroorganizmy.

Najszersza definicja mówi, że antybiotykami są też te związki syntetyczne, które wywierają negatywny wpływ na

mikroorganizmy, a nie mają swoich pierwowzorów wśród naturalnie produkowanych substancji. Celem tego artykułu nie

jest rozważenie, która z tych definicji jest bardziej słuszna. W niniejszej publikacji zastosuję najszerszą definicję

antybiotyku. Pod tym pojęciem będę zatem rozumiał związek chemiczny wykazujący negatywny wpływ na

mikroorganizmy. W dalszej części artykułu będę skupiał się na bakteriach, gdyż to do walki z nimi najczęsciej stosuje się

antybiotyki. Już setki lat temu stosowano spleśniały chleb, aby zabezpieczyć gojące się rany przed zakażeniem. Działania

te były jednak nieświadome i opierały się raczej na obserwacji pozytywnych skutków, a nie na wiedzy dotyczącej

mechanizmu i istoty działania takiego opatrunku. Dopiero w roku 1929 Fleming wykrył penicylinę (rys. 1) - antybiotyk z

grupy β-laktamów. Pojęcie "antybiotyku" zostało wprowadzone dopiero kilkanaście lat później (1943) przez Waksmana -

odkrywcę streptomycy (antybiotyk aminoglikozydowy). W kolejnych latach odkrywano kolejne związki chemiczne,

które hamowały wzrost bakterii. Były to zarówno związki naturalne jak i syntetyczne. Często też stosowano modyfikację

znanych już związków w celu polepszenia ich właściwości antybakteryjnych.

•

Rysunek 1. Wzór antybiotyku - penicyliny. Symbol R oznacza ugrupowanie chemiczne, które może być różne w

zależności od tego z jaką penicyliną mamy do czynienia.

Antybiotyki możemy podzielić według różnych kluczy. Jednym z nich jest podział na grupy o podobnej budowie

chemicznej (m.in. antybiotyki β-laktamowe czy tetracykliny). Podział taki jest mało przydatny dla zwykłego człowieka,

gdyż nie niesie on ze sobą informacji zrozumiałych dla każdego. Dużo sensowniejszy jest podział ze względu na proces

życiowy bakterii, który zakłócają dane związki. Tym sposobem można wyróżnić cztery duże grupy antybiotyków:

• działające na syntezę ściany komórkowej (np. cefalosporyny)

• działające na syntezę białek (np. tetracykliny)

• działające na replikację i naprawę DNA (np. lewofloksacyna)

• działające na syntezę kwasu foliowego (np. sulfonamidy)

W dalszej części artykułu omówię pokrótce każdą z tych grup nie koncentrując się jednak zbytnio na molekularnych

mechanizmach ich działania. Kolejną bardzo ważną rzeczą, z której należy sobie zdawać sprawę jest fakt, że nie

wszystkie antybiotyki działają bakteriobójczo. Uwzględniając stopień szkodliwości danych związków na bakterie

możemy wyróżnić trzy grupy antybiotyków:

• antybiotyki bakteriobójcze (np. chinolony)

• antybiotyki bakteriobójcze w pewnych okolicznościach (np. penicylina)

• antybiotyki bakteriostatyczne (np. chloramfenikol)

Nie wszystko złoto, co się świeci, czyli antybiotykooporność

Wraz ze stosowaniem antybiotyków coraz większa liczba bakterii nabiera zdolności obronnych przed ich szkodliwym

działaniem i leki te wychodzą z użytku. Niektóre gatunki bakterii zawsze były oporne na pewne antybiotyki, inne zaś

zyskały oporność pobierając z otoczenia plazmid z odpowiednim genem lub też na skutek mutacji. Niektóre ze szczepów

bakteryjnych posiadają oporność na bardzo wiele antybiotyków, co zdecydowanie utrudnia walkę z zakażeniami przez

nie wywoływanymi. Przykładem mogą tu być szczepy MRSA Staphylococcus aureus (Methicilin Resistant

Staphylococcus Aureus ). Należy zastanowić się, jakie są możliwe mechanizmy obrony mikroorganizmów przed

antybiotykami. Zasadniczo wszystkie poznane dotąd mechanizmy można podzielić pomiędzy cztery osobne grupy:

• zmniejszenie wewnątrzkomórkowego stężenia antybiotyku

• modyfikacja prowadząca do inaktywacji antybiotyku

• ominięcie procesu blokowanego przez antybiotyk

• modyfikacja "celu", na który normalnie działa antybiotyk

•

Rysunek 2. Cztery główne drogi antybiotykooporności. Rysunek nie zachowuje skali wielkości. 1 - zmniejszenie

wewnątrzkomórkowego stężenia antybiotyku (poprzez a - niedopuszczenie do wniknięcia do komórki, b -

wypompowywanie z komórki), 2 - modyfikacja antybiotyku (poprzez: a - "zniszczenie" jakiegoś ugrupowania

chemicznego, b - dodanie jakiegoś ugrupowania chemicznego), 3 - ominięcie procesu blokowanego przez antybiotyk, 4 -

modyfikacja "celu"

Oczywiście oporność bakterii na dany antybiotyk może być wynikiem współdziałania kilku różnych mechanizmów.

Omówmy pokrótce te cztery najważniejsze mechanizmy obronne. Podstawą skutecznego działania antybiotyków jest ich

przeniknięcie do wnętrza komórki lub przynajmniej do wnętrza ściany komórkowej i działanie tam na odpowiednie

procesy. Jeśli na skutek różnych modyfikacji w budowie ściany komórkowej antybiotyk nie będzie mógł wniknąć do

komórki (lub będzie wnikał w bardzo małej ilości) to rozwój bakterii nie zostanie powstrzymany lub będzie

powstrzymywany w bardzo małym stopniu. Oporność powstająca na skutek zwykłego pogrubienia ściany komórkowej

nie jest zbyt silna i zwykle powiększenie stężenia antybiotyku powinno pozwolić na zabicie bakterii. Jeśli jednak nastąpią

mutacje i zmiany w białkach tworzących pory w błonie komórkowej to oporność może być dużo silniejsza. Przykładem

jest oporność na chinolony (mutacja porów powoduje też często wzrost oporności na inne antybiotyki). Mechanizm

wypompowywania antybiotyku z komórki bakteryjnej prowadzi zasadniczo do tego samego - do uniemożliwienia

kontaktu antybiotyku z celem. Za wyprowadzenie antybiotyku poza komórkę odpowiedzialne są specjalne pompy.

Naukowcy podzielili je na kilka klas. Jednak najważniejszy jest ogólny podział na pompy specyficzne względem danego

antybiotyku lub danej klasy antybiotyków (np. pompy usuwające z komórek tetracykliny) oraz na pompy działające na

szereg różnych związków (np. rodzina MATE - Multidrug and Toxic compounds Extrusion). Oporność polegająca na

modyfikacji prowadzącej do inaktywacji antybiotyku jest stosunkowo prostą metodą. Opiera się ona o enzymatyczne

przekształcenie antybiotyku tak, aby przestał on zagrażać podstawowym procesom komórkowym. Sposób

modyfikowania antybiotyku może być różny. Najbardziej klasycznym przykładem jest tu przecinanie pierścienia β-

laktamowego (np. penicyliny) poprzez β-laktamazy. Inną strategię inaktywacji antybiotyku (linkomycyny) stosuje

Streptococcus agalactiae (jeden z paciorkowców). Odpowiedni enzym (dokładniej jedna z nukleotydylotransferaz)

przyłącza do linkomycyny (a także niektórych innych antybiotyków) resztę adenylową (z ATP) i powstający kompleks

nie wykazuje aktywności bakteriobójczej. Mechanizm polegający na ominięciu procesu blokowanego przez antybiotyk

jest dosyć oczywisty. Jeśli stosowany lek blokuje jeden z enzymów potrzebnych przy syntezie ściany komórkowej to jest

możliwe, że komórka będzie posiadać inny enzym, który będzie pełnił tę samą funkcję, a jednocześnie będzie

niewrażliwy na działanie antybiotyku. Taki mechanizm występuje np. u MRSA. Dzięki temu te szczepy gronkowca

wykazują oporność na antybiotyki β-laktamowe. Ostatnim z mechanizmów oporności jest modyfikacja "celu" (ang.

target), na który działa antybiotyk. Doskonałym przykładem jest oporność niektórych bakterii (np. gronkowców) na

erytromycynę. Normalnie ten antybiotyk przyłącza się do 23SrRNA w rybosomach. Jednak na skutek działania enzymu

erm (erythromycin ribosome methylase) z jednej z adenin w tym RNA usuwana jest grupa metylowa. Powoduje to, że

antybiotyk nie może się przyłączyć do rybosomu, a tym samym nie blokuje translacji białek. Skoro bakterie wykazują

antybiotykooporność, to lekarze (a także naukowcy) powinni być w stanie ocenić na jakie antybiotyki oporny jest szczep

wyizolowany od danego pacjenta. Oczywiście opracowane są odpowiednie procedury. Część z nich jest dosyć łatwa do

przeprowadzenia i znana od dawna, inne zaś opierają się o najnowsze odkrycia biologii molekularnej. Co ciekawe,

metody genetycznego wyznaczania oporności są w zasadzie mniej skuteczne od dawnych metod opierających się na

badaniu wpływu antybiotyku na rozwój bakterii. Wadą technik opierających się o poszukiwanie genu oporności jest to, że

potrafimy wykryć tylko te geny, które już znamy. Oprócz tego na skutek mutacji w genie możemy go nie wykryć nawet

jeśli jego aktywność się nie zmieniła. Oczywiście techniki genetyczne posiadają też różne zalety, jednak nie można na ich

podstawie wyciągać ostatecznych wniosków. Do bardziej tradycyjnych technik należy wyznaczanie MIC (Minimal

Inhibitory Concentration) - czyli wyznaczanie minimalnego stężenia antybiotyku wywołującego zahamowanie wzrostu

bakterii oraz antybiogram.

• wyznaczenie MIC polega na przygotowaniu seryjnego rozcieńczenia danego antybiotyku w odpowiedniej

pożywce, a następnie zaszczepieniu takiej pożywki daną ilością bakterii (ważne jest by do każdego rozcieńczenia

antybiotyku dodać taką samą ilość bakterii). Po inkubacji serii rozcieńczeń w odpowiednich warunkach możemy

zaobserwować przy jakim stężeniu widać zahamowanie wzrostu, a przy jakim nie. Test ten jest bardzo prosty do

wykonania i nawet niewprawna osoba jest w stanie odczytać wyniki.

• W celu zbadania antybiogramu musimy wysiać bakterie na szalkę z odpowiednią pożywką. Bakterie należy

równomiernie rozprowadzić. Na tak przygotowaną szalkę wykładamy specjalne krążki nasączone różnymi

antybiotykami. Po odpowiedniej inkubacji wokół krążków będziemy widzieli strefy zahamowania wzrostu (jeśli

bakterie były wrażliwe na dany antybiotyk).

Ostatnią kwestią, na którą należy zwrócić uwagę przy omawianiu antybiotykooporności jest oporność krzyżowa. Jest to

zjawisko polegające na tym, że oporność na pewne antybiotyki jest ze sobą powiązana. Znane są liczne przykłady

oporności krzyżowej np. pomiędzy różnymi cefalosporynami (grupa antybiotyków β-laktamowych). Jeśli wiemy, że

pomiędzy daną parą antybiotyków zachodzi oporność krzyżowa to wykonując antybiogram badamy tylko jeden z nich i

wyciągamy wnioski na temat drugiego.

Antybiotyki działające na syntezę ściany komórkowej

Ściana komórkowa będąca najbardziej zewnętrzną częścią komórki bakteryjnej jest oczywiście potencjalnym celem

działania antybiotyków. By zrozumieć działanie tych leków (a przynajmniej części z nich) musimy znać budowę ściany

komórkowej. U bakterii gramdodatnich budowa ta jest dosyć prosta - ściana składa się z wielu warstw peptydoglikanu

(dodatkowo w jej skład wchodzą też inne substancje). Bakterie gramujemne mają bardziej skomplikowaną budowę

ściany komórkowej(ale w jej skład też wchodzi peptydoglikan). Peptydoglikan zwany też mureiną czy muropeptydem

różni się budową u różnych gatunków bakterii, ale zasadniczo można w nim wyróżnić zawsze dwa komponenty:

cukrowy i peptydowy. Pierwszy z nich składa się z dwóch cząsteczek cukru (ściślej N-acetyloglukozaminy i kwasu N-

acetylomuraminowego) drugi zaś stanowi pentapeptyd, który u różnych gatunków ma różny skład. Oba komponenty są

oczywiście połączone. Taka podjednostka ulega polimeryzacji (polimeryzują komponenty cukrowe) tworząc długie

łańcuchy. Za wiązania pomiędzy łańcuchami odpowiedzialny jest komponent peptydowy. Nie wnikając w szczegóły

biochemiczne wystarczy powiedzieć, że enzymy zwane transpeptydazami katalizują tworzenie tych wiązań, a zatem

spajają peptydoglikan w całość. Właśnie transpeptydazy są celem działania wszystkich antybiotyków β-laktamowych

(m.in. penicyliny, cefalosporyny, monobaktam, karbapenemy). Antybiotyki te przyłączają się do enzymu, który powoduje

przecięcie ich pierścienia β-laktamowego. W tej sytuacji połączenie antybiotyk - enzym staje się trwałe i transpeptydazy

nie mogą pełnić swojej funkcji. Wśród najważniejszych mechanizmów oporności na te antybiotyki należy wymienić

specjalne enzymy noszące wspólną nazwę β-laktamaz. Ta grupa enzymów powoduje hydrolizę pierścienia β-

laktamowego i tym samym unieczynnia antybiotyk. Jednak nauka znalazła sposoby na radzenie sobie z tym sposobem

obrony - okazało się mianowicie, że semisyntetyczne pochodne antybiotyków β-laktamowych są gorszym substratem dla

tych enzymów i wolniej ulegają degradacji. Drugą bronią okazał się kwas klawulanowy, który choć posiada pierścień β-

laktamowy to sam nie wykazuje aktywności przeciwbakteryjnej. Jednak po podaniu kwasu klawulanowego wraz z

antybiotykiem β-laktamowym działanie tego antybiotyku jest wzmocnione, gdyż enzymy mające go niszczyć ulegają

inaktywacji poprzez kwas klawulanowy. Oczywiście istnieją β-laktamazy, które nie ulegają inaktywacji pod wpływem

tego kwasu... Inny mechanizm działania wykazują antybiotyki z grupy glikopeptydów (wankomycyna, teicoplanina). Nie

inaktywują one transpeptydaz. Zamiast tego łączą się z ich substratami - podjednostkami mureiny powodując, że stają się

one niedostępne dla transpeptydaz. Antybiotyki te działają tylko na bakterie gramdodatnie (nie mogą przenikać przez

błonę zewnętrzną bakterii gramujemnych). Bakterie oporne na wankomycynę stosują dwie techniki. Pierwszą techniką

jest pogrubienie ściany komórkowej na tyle, by antybiotyk łączył się z zewnętrznymi warstwami peptydoglikanu nie

docierając do miejsca, w którym wbudowywane są kolejne jednostki muropeptydu. Oporność ta nie jest pełna i

zwiększenie stężenia antybiotyku powoduje zabicie bakterii. Drugi mechanizm oporności jest dużo skuteczniejszy -

polega on na enzymatycznej modyfikacji monomerów mureiny tak by antybiotyk nie mógł się do nich przyłączyć.

Antybiotyki działające na syntezę białek

Białka są jednym z podstawowych składników komórki. Blokada ich syntezy jest zawsze szkodliwa i jeśli trwa

wystarczająco długo może prowadzić do śmierci komórki. Z biochemicznego punktu widzenia proces syntezy białek jest

bardzo złożony, jednak jego zarys można dosyć łatwo przedstawić. Pierwszym procesem na drodze od materiału

genetycznego do białka jest transkrypcja czyli przepisanie informacji z DNA na RNA. U bakterii w ten sposób powstaje

od razu dojrzała cząsteczka mRNA (u organizmów wyższych proces ten jest bardziej skomplikowany). Cząsteczka

mRNA przyłącza się w cytoplaźmie komórki do kompleksu białek i kwasów nukleinowych zwanego rybosomem.

Kompleks ten składa się z dwóch podjednostek o różnych funkcjach. Na tym etapie zaczyna się translacja czyli

przepisywanie informacji z mRNA na sekwencję aminokwasów. Odpowiednie cząsteczki tRNA rozpoznają trójki

nukleotydów w mRNA i przyłączają się do nich. Każda cząsteczka tRNA niesie ze sobą konkretny aminokwas. W

rybosomie mRNA przesuwa się i następuje synteza białka. Jak więc widać rybosom jest doskonałym celem działania

antybiotyków. Związki chemiczne przyłączające się do niego mogą albo zablokować syntezę białka, albo spowodować,

że rybosom będzie się "mylił" i powstające białka będą niefunkcjonalne. Znamy antybiotyki przyłączające się do dużej

podjednostki rybosomu (np. makrolidy) jak i do jego małej podjednostki (np. tetracykliny (rys. 3))

•

Rysunek 3. Tetracyklina - jeden z antybiotyków działających na syntezę białek poprzez przyłączenie się do małej

podjednostki rybosomu.

Tetracykliny działają poprzez uniemożliwienie wnikania cząsteczek tRNA niosących aminokwasy do rybosomu. Tym

sposobem blokowana jest synteza białek. Oporność na antybiotyki z grupy tetracyklin najczęściej związana jest z

wypompowywaniem antybiotyku poza komórkę. Oporność części bakterii wynika też z uniemożliwienia wiązania się

tetracykliny do rybosomu lub z enzymatycznej inaktywacji antybiotyku. W odmienny sposób działa mupirocyna, którą

otrzymano z bakterii Pseudomonas fluorescens . Antybiotyk ten blokuje syntezę białka uniemożliwiając wbudowywanie

jednego z aminokwasów - izoleucyny do rosnącego łańcucha polipeptydowego. Mechanizm tej blokady nie jest związany

z rybosomem, a z przyłączaniem aminokwasu do odpowiedniego tRNA. Proces ten katalizowany jest przez odpowiedni

enzym - syntetazę aminoacylo tRNA (każdy aminokwas ma swoją własną syntetazę). Mupirocyna wiąże się z tym

enzymem i tym samym blokuje powstawanie kompleksu tRNA - izoleucyna. Oporność na ten antybiotyk związana jest z

odmienną budową syntetazy. Szczepy bakterii charakteryzujące się wysoką opornością produkują dwie różne odmiany

tego enzymu - normalną - wrażliwą na działanie antybiotyku i zmutowaną - niewrażliwą. Niestety antybiotyk ten ma

ograniczone zastosowanie, gdyż jest nietrwały i można go używać tylko miejscowo (np. w postaci maści do nosa -

przeciw gronkowcowi złocistemu).

Antybiotyki działające na replikację i naprawę DNA

Jednym z podstawowych wyznaczników życia jest zdolność do rozmnażania. W wypadku bakterii rozmanażaniem jest

proste dzielenie się komórek. Jednak by to mogło nastąpić, materiał genetyczny musi ulec podwojeniu w procesie

zwanym replikacją. Podobnie jak synteza białka tak i synteza DNA jest procesem bardzo skomplikowanym. Jednymi z

enzymów, które biorą w niej udział są topoizomerazy. Kolista cząsteczka DNA zawiera liczne superskręty. Przypominają

one splątany i skręcony kabel. Topoizomerazy odpowiedzialne są za rozluźnianie i tworzenie tych superskrętów. Podczas

replikacji superskręty muszą zostać usunięte, ażeby inne enzymy miały swobodny dostęp do DNA. W innych sytuacjach

DNA powinno pozostać superskręcone. Do antybiotyków działających na topoizomerazy należy ogromna grupa

syntetycznych chinolonów (rys. 4). Poprzez przyłączenie się do topoizomeraz blokują one replikację i prowadzą do

śmierci komórki. Niestety bardzo dużo spośród chinolonów wykazuje zbyt dużą toksyczność i przez to nie może być

stosowane w lecznictwie. Dodatkowym problemem jest szybkie pojawianie się oporności na antybiotyki z tej grupy.

Oporność ta często związana jest z mutacjami i zmianami w obrębie topoizomeraz lub też ze zmianami w porach

poprzez, które antybiotyk wnika do komórki.

•

Rysunek 4. Kwas nalidyksowy - pierwszy antybiotyk z olbrzymiej (ponad 10 000) grupy chinolonów

Antybiotyki działające na metabolizm kwasu foliowego

Bardzo ważnym związkiem występującym w żywych organizmach jest kwas tetrahydrofoliowy. Dla ludzi jest to

witamina i jako taka musi być dostarczona z pokarmem. Bakterie posiadają zdolność syntezy tego kwasu. Jego rola w

komórce jest różnoraka. Najogólniej służy on do przenoszenia reszt jednowęglowych. Kwas foliowy w komórkach

bakteryjnych umożliwia syntezę tymidyny, wszystkich puryn oraz niektórych aminokwasów. Jak więc można się

domyślić brak tej substancji powoduje zarówno zablokowanie replikacji DNA jak i transkrypcji i translacji. Sulfonamidy

blokują pierwszy etap bakteryjnej syntezy kwasu foliowego. Leki te wywodzą się od sulfanilamidu, który jest analogiem

strukturalnym kwasu para-aminobenzoesowego (PABA). Związek ten jest przekształcany w kilku etapach do kwasu

foliowego. Sulfonamidy, jako jego analogi strukturalne wiążą się konkurencyjnie do enzymu przekształcającego PABA

(syntetazy dihydropterynianowej - DHPS). Oporność na te leki wynika, albo z nadprodukcji PABA, konkurującego z

lekiem o wiązanie do enzymu, albo też z takiej zmiany DHPS, aby nie wykazywał powinowactwa do sulfonamidów.

Podsumowanie

Temat antybiotyków i oporności bakterii na te związki jest dużo szerszy, a powyżej omówiono tylko kilka przykładów.

Walka człowieka z patogenami trwa już wiele lat. Antybiotyki są jedną z najnowszych broni, które pozwoliły

tymczasowo przechylić szalę zwycięstwa na naszą korzyść. Jednak jak pokazano, bakterie nauczyły się bronić przed

stosowanymi lekami i obecnie występuje coraz więcej patogenów wykazujących oporność na stosowane przez nas

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: