Ćwiczenie 3
Podstawy teoretyczne:
Barwienie złożone – W barwieniu złożonym stosujemy dwa lub więcej barwników, którymi możemy działać na preparat albo kolejno, albo ich mieszaniną. Przy barwieniu złozonym stosuje się często zaprawy (bejce) w celu zwiększenia chłonności barwnika, ułatwienia reakcji chemicznej barwnika z plazmą komórkową i trwałego utrzymania barwnika w komórkach. W zależności od celu badań, tzn. czy chcemy wybarwić komórki, czy tylko tło preparatu (gdy komórki nie chłoną barwników), czy też łącznie komórki i tło (gdy wykrywamy np. otoczki bakteryjne), metody barwienia dzieli się następująco:
a) barwienie pozytywne,
b) barwienie negatywne,
c) barwienie negatywno – pozytywne.
Barwienie pozytywne – barwienie pozytywne ma na celu wybarwienie komórek drobnoustrojów na niezabarwionym tle. Ten sposób jest w mikrobiologii najczęściej stosowany.
Barwienie negatywne – w barwieniu negatywnym stosuje się barwnik o charakterze tuszu, który służy do zabarwienia tła preparatu. Różni się on od właściwych barwników bakteriologicznych brakiem dostatecznej dyspresji i dlatego nie wnika do wnętrza komórek. W metodzie tej można używać tuszu chińskiego, nigrozyny, cyjanochiny, kolargolu lub czerwieni Kongo. Barwienie negatywne służy do obserwacji bakterii nie wchłaniających uniwersalnych barwników bakteriologicznych. Przykładem takich bakterii może być krętek blady – Treponema pallidum. Wynikiem barwienia negatywnego jest uzyskanie wyraźnego obrazu niezabarwionych bakterii na ciemnym tle.
Barwienie negatywno – pozytywne – metoda negatywno – pozytywna jest kombinacją barwienia negatywnego i pozytywnego. Zasada jej polega na stosowaniu jednego z wymienionych przy metodzie negatywnej barwników gruboziarnistych, z którym miesza się zawiesinę bakterii i rozprowadza się ją na szkiełku, a następnie zabarwia komórki właściwym barwnikiem kateriologicznym zwykle fuksyną lub błękitem metylenowym.
Najczęściej stosowaną, a zarazem zawsze obowiązującą jest metoda Grama, która pozwala od razu podzielić badane drobnoustroje na dwie podstawowe grupy:
1) bakterie gramdodatnie,
2) bakterie gramujemne.
W metodzie Grama posługujemy siędwoma barwnikami ( podstawowym i kontrastowym), jednym bejcem (płyn Lugola) i jednym odbarwieniem (etanol).
Po utrwaleniu, ostudzeniu i umieszczeniu preparatu na ramce wanienki do barwienia należy wykonać następujące czynności:
a) nalać na preparat za pomocą pipetki lub kroplomierza roztwór fioletu goryczki i pozostawić na 1 – 2 minut,
b) spłukać wodą,
c) nalać na preparat płyn Lugola i pozostawić go przez 1 – 2 minut,
d) spłukać wodą,
e) odbarwiać preparat alkoholem etylowym do momentu spływania bezbarwnych kropli alkoholu ze szkiełka przedmiotowego,
f) spłukać wodą,
g) nalać na preparat roztwór fuksyny zasadowej i pozostawić ją na 30 sekund,
h) spłukać wodą,
i) wysuszyć preparat bibułą (gładką bez kłaczków!).
Wynikiem barwienia metodą Grama jest zabarwienie się bakterii gramdodatnich na kolor niebiesko-fioletowy, a bakterii gramujemnych na kolor różowo-czerwony.
Cel ćwiczenia:
Zapoznanie się z techniką barwienia komórek bakteryjnych metodą Grama, oraz barwienie bakterii przetrwalnikujących metodą Wirtza.
Zakres ćwiczenia:
Każdy student powinien sporządzić i obejrzeć co najmniej 3 preparaty komórek bakteryjnych, w tym 2 preparaty barwione metodą Grama oraz jeden preparat barwiony metodą Wirtza.
goldapianie