łańcuchowa reakcja polimerazy-PCR.pdf

(768 KB) Pobierz

Agrobiotechnologia

Temat:

Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR).

Agrobiotechnologia

ŁAŃCUCHOWA REAKCJA POLIMERAZY

 PCR jest jednąz najpotężniejszych

technik wykorzystywanych w biologii

molekularnej

 Wymyślona i zaprojektowana przez

KaryMullis’aw1983(1993 Nobel, w

dziedzinie chemii)

http://www.leelofland.com/wordpress/?p=6815

812267989.041.png

812267989.042.png

812267989.043.png

812267989.044.png

812267989.001.png

812267989.002.png

812267989.003.png

812267989.004.png

Agrobiotechnologia

Fragment KlenowaPolimerazy I E.coli

http://eshop.intronbio.com/index.php?var=Good&Good_no=452

- pierwsza polimeraza użyta do PCR

- nie jest termostabilna

- po każdej denaturacji nowa porcja enzymu

Agrobiotechnologia

Polimerazy termostabilne

Wiele termostabilnychpolimerazo aktywności DNA polimerazy

typu I, izolowanych jest z ekstremotermofilinależących do

Archebacteria (temp. optymalna powyżej 80 0 C) izolowanych z dna

oceanów w pobliżu kominów geotermalnych.

http://wiedza.ekologia.pl/energia-odnawialna/

http://pl.wikipedia.org/wiki/Ziemia-%C5%9Bnie%C5%BCka

812267989.005.png

812267989.006.png

812267989.007.png

812267989.008.png

812267989.009.png

812267989.010.png

812267989.011.png

812267989.012.png

812267989.013.png

Agrobiotechnologia

Przebieg reakcjiPCR

Cykliczne zmiany temperatury:

95 0 C –denaturacja DNA

55 0 C-65 0 C –przyłączanie starterów do DNA

68 0 C-72 0 C –synteza nowego fragmentu DNA

Agrobiotechnologia

Przebieg reakcjiPCR

55 0 C

812267989.014.png

812267989.015.png

812267989.016.png

812267989.017.png

812267989.018.png

812267989.019.png

812267989.020.png

812267989.021.png

812267989.022.png

Agrobiotechnologia

Do reakcji PCR jest potrzebne:

1. Matryca DNA (lub RNA)

2. Startery (dwa różne)

3. Wolne nukleotydy (dNTP)

4. Polimeraza termostabilna

5. Bufor, jony Mg 2+

Agrobiotechnologia

Matryca DNA

Ilość matrycowego DNA mieści się w zakresie:

Plazmidowy lub fagowyDNA 0,01-1 ng

GenomowyDNA 100-1000 ng

Większa ilość matrycowego DNA, zwiększa

ilość niespecyficznych produktów PCR.

812267989.023.png

812267989.024.png

812267989.025.png

812267989.026.png

812267989.027.png

812267989.028.png

812267989.029.png

812267989.030.png

Agrobiotechnologia

CZY MOŻNA AMPLIFIKOWAC RNA ?

Termostabilna POLIMERAZA DNA wymaga matrycy DNA, nie będzie

kopiować RNA mRNA musi zostać najpierw „przepisane” na cDNA z

użyciem ODWROTNEJ TRANSKRYPTAZY (RT-PCR)

cDNA jest matrycą w reakcji PCR –DNA nie musi być dwuniciowe

KIEDY AMPLIFIKUJEMY RNA ?

-badany organizm nie zawiera DNA, np. retrowirusy

-chcemy zbadać aktywność genu a nie jedynie jego obecność

w genomie

Agrobiotechnologia

Startery –krótkie fragmenty oligonukleotydowe(16-24 pz)

komplementarne do matrycy, flankują amplifikowany fragment

●powinny mieć wyrównaną zawartość zasad G/C i A/T

● Tm 55-65˚C, oba startery powinny miećzbliżonątemperaturętopnienia

● nie powinny zbyt silnie wiązać się na końcu 3’

● specyficzność końca 3’ decyduje o powodzeniu amplifikacji

●nie powinny tworzyćwewnętrznych struktur 2-rzędowych

● nie mogą komplementować między sobą

● stężenie 0.1-0.5 μM (za dużo -pomyłki, za mało -mniej produktu).

812267989.031.png

812267989.032.png

812267989.033.png

812267989.034.png

812267989.035.png

812267989.036.png

812267989.037.png

812267989.038.png

812267989.039.png

812267989.040.png

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Postępy fizjologii roślin, a możliwości wzrostu.ppt (21696 KB)
Molecular Diagnostics - Fundamentals Methods and Clinical Applications - Buckingham_ Flaws.pdf (36427 KB)
Ćw.lab1_Gleb-wilg.gleby_OŚ.pdf (162 KB)
gen eukariota.pdf (7736 KB)
Stan struktury gruzełkowatej gleby.doc (1902 KB)

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin