łańcuchowa reakcja polimerazy-PCR.pdf
(
768 KB
)
Pobierz
Agrobiotechnologia
Temat:
Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR).
Agrobiotechnologia
ŁAŃCUCHOWA REAKCJA POLIMERAZY
PCR jest jednąz najpotężniejszych
technik wykorzystywanych w biologii
molekularnej
Wymyślona i zaprojektowana przez
KaryMullis’aw1983(1993 Nobel, w
dziedzinie chemii)
http://www.leelofland.com/wordpress/?p=6815
Agrobiotechnologia
Fragment KlenowaPolimerazy I
E.coli
http://eshop.intronbio.com/index.php?var=Good&Good_no=452
-
pierwsza polimeraza użyta do PCR
-
nie jest termostabilna
-
po każdej denaturacji nowa porcja enzymu
Agrobiotechnologia
Polimerazy termostabilne
Wiele termostabilnychpolimerazo aktywności DNA polimerazy
typu I, izolowanych jest z ekstremotermofilinależących do
Archebacteria
(temp. optymalna powyżej 80
0
C) izolowanych z dna
oceanów w pobliżu kominów geotermalnych.
http://wiedza.ekologia.pl/energia-odnawialna/
http://pl.wikipedia.org/wiki/Ziemia-%C5%9Bnie%C5%BCka
Agrobiotechnologia
Przebieg reakcjiPCR
Cykliczne zmiany temperatury:
95
0
C –denaturacja DNA
55
0
C-65
0
C –przyłączanie starterów do DNA
68
0
C-72
0
C –synteza nowego fragmentu DNA
Agrobiotechnologia
Przebieg reakcjiPCR
55
0
C
Agrobiotechnologia
Do reakcji PCR jest potrzebne:
1. Matryca DNA (lub RNA)
2. Startery (dwa różne)
3. Wolne nukleotydy (dNTP)
4. Polimeraza termostabilna
5. Bufor, jony Mg
2+
Agrobiotechnologia
Matryca DNA
Ilość matrycowego DNA mieści się w zakresie:
Plazmidowy lub fagowyDNA 0,01-1 ng
GenomowyDNA 100-1000 ng
Większa ilość matrycowego DNA, zwiększa
ilość niespecyficznych produktów PCR.
Agrobiotechnologia
CZY MOŻNA AMPLIFIKOWAC RNA ?
Termostabilna POLIMERAZA DNA
wymaga matrycy DNA, nie będzie
kopiować RNA mRNA musi zostać najpierw „przepisane” na cDNA z
użyciem
ODWROTNEJ TRANSKRYPTAZY (RT-PCR)
cDNA jest matrycą w reakcji PCR –DNA nie musi być dwuniciowe
KIEDY AMPLIFIKUJEMY RNA ?
-badany organizm nie zawiera DNA, np. retrowirusy
-chcemy zbadać aktywność genu a nie jedynie jego obecność
w genomie
Agrobiotechnologia
Startery –krótkie fragmenty oligonukleotydowe(16-24 pz)
komplementarne do matrycy, flankują amplifikowany fragment
●powinny mieć wyrównaną zawartość zasad G/C i A/T
● Tm 55-65˚C, oba startery powinny miećzbliżonątemperaturętopnienia
● nie powinny zbyt silnie wiązać się na końcu 3’
● specyficzność końca 3’ decyduje o powodzeniu amplifikacji
●nie powinny tworzyćwewnętrznych struktur 2-rzędowych
● nie mogą komplementować między sobą
● stężenie 0.1-0.5 μM (za dużo -pomyłki, za mało -mniej produktu).
Plik z chomika:
anuszka66
Inne pliki z tego folderu:
Postępy fizjologii roślin, a możliwości wzrostu.ppt
(21696 KB)
Molecular Diagnostics - Fundamentals Methods and Clinical Applications - Buckingham_ Flaws.pdf
(36427 KB)
Ćw.lab1_Gleb-wilg.gleby_OŚ.pdf
(162 KB)
gen eukariota.pdf
(7736 KB)
Stan struktury gruzełkowatej gleby.doc
(1902 KB)
Inne foldery tego chomika:
Analiza instrumentalna
Etykieta menadżerska
rolnictwo ekologiczne
Wykłady rośliny energetyczne
Wykłady z postępu biologicznego
Zgłoś jeśli
naruszono regulamin