Duplikacje chromosomowe na chromosomie Y i ich potencjalny wpływ na interpretację Y-STR.pdf

PRZEK£ADY

J.M. Butler, Amy E. Decker, Margaret C. Kline, Peter M. Vallone

Duplikacje chromosomowe na chromosomie Y

i ich potencjalny wp³yw na interpretacjê Y-STR

Journal of Forensic Sciences, 2005, vol. 50, nr 4

Chromosom Y jest specyficzny dla

osobników mêskich, co decyduje

o mo¿liwoœci jego wykorzystania

w badaniach dotycz¹cych napaœci na

tle seksualnym, kiedy istnieje potrze-

ba identyfikacji DNA sprawcy przy

przewa¿aj¹cej iloœci ¿eñskiego DNA

ofiary (ryc. 3). Na chromosomie Y zi-

dentyfikowano szereg markerów

krótkich powtórzeñ tandemowych

(STR), na podstawie których stwo-

rzono multipleksowe sondy reakcji

³añcuchowej polimerazy (PCR),

umo¿liwiaj¹ce rozró¿nianie niespo-

krewnionych mê¿czyzn.

Jedno z potencjalnych zastoso-

wañ badania Y-STR to ustalanie licz-

by osób, których materia³ biologiczny

znalaz³ siê w materiale dowodowym

w przypadkach zgwa³ceñ zbioro-

wych. W takich sytuacjach mamy

czêsto do czynienia z mieszanym

profilem, który jest interpretowany

drog¹ badania liczby oraz wzglêd-

nych wysokoœci pików wystêpuj¹cych

w danym locus. Wiêkszoœæ po-

wszechnie stosowanych markerów Y-

STR to pojedyncze kopie, z wyj¹t-

kiem locus polimorficznego DYS385.

Poniewa¿ wiêc chromosom Y nie ma

chromosomu w pe³ni homologiczne-

go, obserwujemy tylko jeden produkt

PCR w wyniku amplifikacji markera

Y-STR za pomoc¹ jednej pary prime-

rów PCR. Jednak ostatnio, w czasie

przeprowadzania studium populacyj-

nego, stwierdzono, ¿e w ponad 1%

badanych próbek wyst¹pi³o wiele al-

leli z loci, które wczeœniej uwa¿ano

za markery pojedynczych kopii. Poza

tym zaobserwowaliœmy jednoczesn¹

duplikacjê nawet w czterech ró¿nych

loci Y-STR i „jednej kopii”, pochodz¹-

cych od jednej osoby. W tym krótkim

opracowaniu zostanie omówiony

wp³yw duplikowanych (a nawet triple-

towanych) regionów chromosomu Y

na ocenê tego, czy w materiale do-

wodowym wystêpuje mieszanina

DNA pochodz¹ca od wielu dawców.

i DYS439. Amplifikacjê PCR przepro-

wadzono zgodnie z instrukcjami pro-

ducenta w 30 cyklach i na 1–2 ng ma-

trycy DNA. Wykonano te¿ badania za

pomoc¹ NIST 20plex i 11plex.

Wykrywanie i analiza produktów PCR

Rozdzia³ i wykrywanie produktów

PCR przeprowadzono na sekwenato-

rze ABI Prism ® 310 albo ABI

PRISM ® 3100 (system 16-kapilaro-

wy) (Applied Biosystems) zgodnie

z protoko³ami producenta. Po zebra-

niu danych przeanalizowano próbki

za pomoc¹ Genescan ® 3.7 (Applied

Biosystems) i oznaczono allele za

pomoc¹ Genotypera 3.7 (Applied

Biosystems).

Materia³y i metody

Próbki DNA

Anonimowe próbki krwi p³ynnej

o znanej przynale¿noœci etnicznej za-

kupiono w Miêdzystanowym Banku

Krwi (Interstate Blood Bank) w Mem-

phis w stanie Tennessee i firmie Mil-

lenium Biotech, Inc. (Ft. Launderdale

w stanie Floryda) zgodnie z przepisa-

mi NIST (National Institute of Stan-

dards and Technology). Z próbek

tych uprzednio izolowano DNA i typo-

wano za pomoc¹ 15 autosomalnych

STR, z zastosowaniem kitu Amp-

FISTR ® Identifiler™ (Applied Biosys-

tems z Foster City w Kalifornii). Mia³o

to na celu wykazanie, ¿e próbki siê

nie powtarzaj¹ i nie s¹ mieszaninami.

Wyniki i omówienie

Duplikacje w wielu loci

w obrêbie jednej próbki

Przeprowadzaj¹c przegl¹d oko³o

650 prób populacyjnych w USA, au-

torzy zaobserwowali w pewnej liczbie

próbek duplikacje w kilku loci Y-STR.

Niektóre z tych próbek zbadano po-

nownie przy u¿yciu kitu PowerPlex Y,

aby zweryfikowaæ fakt wystêpowania

wielu alleli w ró¿nych loci Y-STR.

Ryc. 1 przedstawia wyniki z Genoty-

pera dla jednej z tych próbek, w któ-

rych zaobserwowano wiele alleli Y-

-STR w wiêcej ni¿ jednym locus. Na-

le¿y zauwa¿yæ, ¿e w locus DYS385

czêsto obserwuje siê dwa allele, po-

niewa¿ na chromosomie Y czêsto

Odczynniki Y-STR

Przy u¿yciu kitu PowerPlex®

z Promega Corporation (z Madison

w stanie Wisconsin) amplifikowano

loci Y-STR: DYS19, DYS385a/b,

DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS-

-392, DYS393, DYS437, DYS438

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05

PRZEK£ADY

jedynczych kopii i dlatego przy ampli-

fikacji powinny dawaæ tylko jeden pik,

je¿eli materia³ pochodzi tylko od jed-

nego mê¿czyzny – autorzy postano-

wili zbadaæ zjawisko duplikacji marke-

ra Y-STR trochê dok³adniej i rozwa-

¿yæ jego potencjalny wp³yw na wykry-

wanie mieszanin mê¿czyzna-mê¿-

czyzna za pomoc¹ badania Y-STR.

Triplikacje

Próbkê, w której stwierdzono trzy

allele w DYS19 z powodu triplikacji

locus DYS19, amplifikowano przy

u¿yciu kitu PowerPlex Y. Nale¿y za-

uwa¿yæ, ¿e wszystkie trzy allele dla

DYS19 s¹ zbli¿one do siebie pod

wzglêdem wysokoœci piku i ¿e

Ryc. 1. Elektroferogram PowerPlex Y dla próbki

zawieraj¹cej materia³ od jednego mê¿czyzny z

wieloma allelami w loci „pojedynczej kopii”

DYS389I, DYS389II, DYS439 i DYS437

(zaznaczone). Jednorodnoœæ próbki potwierdzono

poprzez badanie 15 STR autosomalnymi za

pomoc¹ zestawu Identifiler. Warunki zgodne z

opisem w czêœci „Materia³y i Metody” dla 1 ng

DNA i wykrywaniem na ABI 3100.

Tabela 1

Zestawienie duplikacji albo triplikacji dla czêstych loci Y-STR. Informacje pochodz¹

z Y-STR Haplotype Reference Database (http://www.yhrd.org), wydania 13. z 1 lipca

2004, sk³adaj¹cego siê z 25 066 minimalnych haplotypów. Wartoœci wyt³uszczone

obejmuj¹ allele rozdzielone jedn¹ jednostk¹ powtórzeñ. AMG oznacza informacje

otrzymane od Ann Marie Gross z Laboratorium Kryminalistycznego Biura Kryminalne-

go w Minnesocie. *Nomenklatura DYS448 za Redd i wsp.

wystêpuj¹ dwie kopie. Poniewa¿ sy-

gna³y alleli DYS3891, DYS439, DY-

389II i DYS437 s¹ praktycznie równe

w obrêbie ka¿dego locus, na pierw-

szy rzut oka to spostrze¿enie mo¿e

sugerowaæ obecnoœæ dwóch mêskich

komponentów w podobnych ilo-

œciach. Jednak w tej konkretnej prób-

ce, która by³a te¿ badana za pomoc¹

15 loci autosomalnych STR, stwier-

dzono proporcjonalne heterozygo-

tyczne allele w 13 loci, a homozygoty

tylko w TPOX i D5S818. Poniewa¿

po zbadaniu tak wielu polimorficz-

nych STR w ¿adnym locus autoso-

malnym STR nie stwierdzono wystê-

powania wiêcej ni¿ dwóch alleli, jest

ma³o prawdopodobne, ¿e w tej kon-

kretnej próbce wystêpuje dobrze

zrównowa¿ona mieszanina materia³u

od dwóch ró¿nych mê¿czyzn.

Ze wzglêdu na fakt, ¿e loci DYS-

389I, DYS439, DYS389II i DYS437

s¹ zwykle uznawane za markery po-

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05

PRZEK£ADY

wszystkie wysokoœci pików alleli z in-

nych loci s¹ zbli¿one, co sugeruje, ¿e

ka¿dy zaobserwowany allel wystêpu-

je na chromosomie Y tylko raz.

Chocia¿ triplikacje s¹ rzadsze,

Ÿród³a donosz¹ o ich wystêpowaniu

w DYS19 i DYS385. Triplikacje

w DYS385 mog¹ powstawaæ w wyni-

ku duplikacji jednego z ju¿ zdupliko-

wanych alleli DYS385 albo duplikacji

ca³ego regionu chromosomu Y, za-

wieraj¹cego allel „a” i „b”. Czêsto su-

ma tych dwóch alleli jest równa inne-

mu allelowi z duplikacjami DYS385.

Model duplikacji locus Y-STR

i dywergencji

Analiza skoñczonej sekwencji re-

gionu eurochromatycznego chromo-

somu Y pozwala zauwa¿yæ, ¿e du¿a

czêœæ sekwencji chromosomu Y po-

jawia siê wiêcej ni¿ jeden raz, czêsto

we wzorze palindromicznym. Ponie-

wa¿ na chromosomie Y zdaje siê wy-

stêpowaæ niewiele genów, istniej¹

mniejsze ograniczenia co do utrzy-

mania konkretnego kontekstu se-

kwencji i dlatego mo¿liwe s¹ polimor-

fizmy insercji du¿ych regionów chro-

mosomu Y. Przy braku rekombinacji

z innymi chromosomami istnieje du¿e

prawdopodobieñstwo akumulacji

zdarzeñ insercji na chromosomie Y,

co prowadzi do powstania licznych

kopii, czyli obszarów przy³¹czenia al-

leli dla loci, które pocz¹tkowo by³y

markerami jednej kopii. Niedawno

doniesiono o tym zjawisku dla obsza-

rów flankowania DYS19. Po amplifi-

kacji PCR zamiast jednej kopii locus

amplifikowano dwie, je¿eli na chro-

mosomie Y istnia³y dwa obszary

przy³¹czenia. Duplikacje mog¹ te¿

skomplikowaæ interpretacjê polimorfi-

zmu pojedynczego nukleotydu chro-

mosomu Y (Y-SNP) z loci takimi jak

P25 i 92R7, utrudniaj¹c te¿ ewentual-

n¹ interpretacjê mieszaniny z tymi lo-

ci, które wystêpuj¹ wiele razy na

chromosomie Y.

Ryc. 3 pokazuje, jak wyst¹pienie

duplikacji Y-STR mo¿e powodowaæ

Ryc. 2. Elektroferogram PowerPlex Y próbki zawieraj¹cej materia³ od jednego mê¿czyzny, w którym

stwierdzono trzy allele w DYS19. Warunki zgodne z opisem w czêœci „Materia³y i Metody” dla 1 ng DNA

i wykrywaniem na ABI 3100.

Ryc. 3. Schemat procesu duplikacji i dywergencji, który mo¿e doprowadziæ do powstania mnogich alleli

na chromosomie Y, kiedy wykorzystuje siê specyficzne dla locus primery Y-STR. Najpierw dochodzi do

duplikacji odcinka (a) i powstaje odcinek (a’), który nastêpnie mo¿e z czasem podlegaæ mutacji w

odnoœnym locus Y-STR poprzez nabycie albo utratê jednostki powtórzenia, aby stworzyæ allel

oznaczony (b). Zauwa¿my, ¿e najlepiej zauwa¿alne allele powinny znajdowaæ siê w odleg³oœci jednej

jednostki powtórzenia, poniewa¿ mutacje jednostopniowe s¹ najpowszechniejsze dla markerów STR.

pojawienie siê najpierw zduplikowa-

nego regionu (a’) w innym miejscu na

chromosomie Y. Region ten mo¿e na-

stêpnie niezale¿nie mutowaæ z up³y-

wem czasu z prêdkoœci¹ oko³o 10 - 3

na generacjê, jednostopniowo, pro-

wadz¹c do powstania allela „b”, który

najprawdopodobniej bêdzie siê ró¿ni³

od orygina³u o jedn¹ jednostkê po-

wtórzenia.

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05

PRZEK£ADY

Duplikowane mog¹ byæ ca³e od-

cinki chromosomu Y, obejmuj¹ce set-

ki par zasad (kb). Markery Y-STR fi-

zycznie le¿¹ce niedaleko siebie na

chromosomie Y mog¹ po duplikacji

wykazywaæ dywergencyjne allele

specyficzne dla loci w tej samej prób-

ce DNA. Istotne jest to, ¿e próbki,

w których wyst¹pi³y konkret-

ne duplikacje, na przyk³ad al-

leli 15 i 16 DYS19, wszystkie

mog¹ nale¿eæ do tej samej

haplogrupy. Tabela 2 przed-

stawia zestawienie wszyst-

kich pozycji markera Y-STR

dla obecnie najczêœciej u¿y-

wanych loci. Zauwa¿my, ¿e

DYS437, DYS439 i DYS-

389I/II, które s¹ duplikowane

w próbce przedstawionej na

ryc. 1, wystêpuj¹ w odleg³o-

œci nie wiêkszej ni¿ 150 kb od

siebie i dlatego jest bardziej

prawdopodobne, ¿e by³y du-

plikowane razem. Ten region

AZFa chromosomu Y zosta³

tak¿e odnotowany przez Bo-

scha i Joblinga jako dupliko-

wany u niektórych jednostek.

Prinz, ustalenie liczby dawców nasie-

nia w przestêpstwach na tle seksual-

nym jest normalnie du¿o prostsze

przy u¿yciu Y-STR, poniewa¿ ¿eñski

komponent DNA nie jest wykrywany.

Jak widaæ na ryc. 4, w tej konkret-

nej mieszaninie dwóch sk³adników

mêskich wiêkszoœæ loci Y-STR o jed-

koœæ pozosta³ych pików Y-STR w tym

samym kolorze, co sugeruje, ¿e wy-

stêpuj¹ dwie kopie allela 11 – po jed-

nej od ka¿dego dawcy p³ci mêskiej.

Zauwa¿my tak¿e, ¿e w tej konkretnej

mieszaninie locus DYS439 ma allele

10 i 13, które ró¿ni¹ siê trzema jed-

nostkami powtórzeñ. Podobnie DYS-

-437 zawiera allele 14 i 16,

które s¹ w odleg³oœci dwóch

jednostek powtórzeñ.

W tym przyk³adzie, w któ-

rym wyraŸny stosunek wyso-

koœci/pól pików od poszcze-

gólnych dawców jest bliski 1:

1, nie jest mo¿liwe przypisa-

nie z pewnoœci¹ alleli „wiêk-

szoœciowemu” czy „mniej-

szoœciowemu” dawcy (wa¿-

ne, by odnotowaæ, ¿e wiêk-

szoœæ mieszanin spotyka-

nych w œladach prawdopo-

dobnie nie bêdzie pozosta-

wa³a w stosunku 1:1). Za-

miast przypisywania alleli

konkretnym dawcom w celu

stworzenia haplotypów Y-

STR, które mo¿na by porów-

naæ z baz¹ danych, jest bar-

dziej prawdopodobne, ¿e

dojdzie do wykluczenia albo

potwierdzenia zgodnoœci po-

dejrzanego z profilem mate-

ria³u dowodowego. Przypisa-

nie alleli konkretnemu dawcy

w celu stworzenia z³o¿onego

haplotypu Y-STR najprawdo-

podobniej by³oby ³atwiejsze

przy mieszaninie o nierów-

nych proporcjach (np. 3:1 za-

miast 1:1).

Tabela 2. Fizyczna lokalizacja 50 markerów Y-STR na

chromosomie Y na podstawie przeszukania sekwencyjnego

z wykorzystaniem zestawienia sekwencji Human Genome,

z lipca 2003 (http://genome.ucsc.edu). Pozycje w megaza-

sadach (Mb) s¹ zaokr¹glone do najbli¿szego tysi¹ca par za-

sad. Loci badane w niniejszym artykule s¹ wyt³uszczone.

Bliskie s¹siedztwo zduplikowanych loci zaobserwowanych

na ryc. 1 (DYS437, DYS439, DYDS389I, YS389II) zazna-

czono ramk¹, sugeruj¹c¹, ¿e ten ca³y region zosta³ zdupli-

kowany, a potem, z up³ywem czasu, nast¹pi³a dywergencja

alleli STR.

Przyk³ad mieszaniny

mê¿czyzna-mê¿czyzna

Aby sprawdziæ, czy zaob-

serwowan¹ duplikacjê locus

Y-STR mo¿na odró¿niæ od

prawdziwej mieszaniny mê¿-

czyzna-mê¿czyzna, zbadano

próbkê zawieraj¹c¹ materia³

od dwóch ró¿nych mê¿czyzn

za pomoc¹ zestawu Power-

Plex Y. Tê konkretn¹ miesza-

ninê dok³adnie zanalizowano

wczeœniej jako „próbkê X”

w studium NIST Mixed Stain

Study #3, poniewa¿ zawiera

przewa¿aj¹c¹ iloœæ DNA ¿eñ-

skiego i dwa komponenty mêskie.

Poszczególne sk³adniki z oznacze-

niami autosomalnego allela STR mo-

g¹ byæ trudne do rozszyfrowania, kie-

dy w próbce wystêpuje DNA od wiê-

cej ni¿ jednego dawcy. Jak zauwa¿y³

Rozró¿nianie mieszaniny

od duplikacji locus

nej kopii ma wiêcej ni¿ jeden pik i wy-

soce polimorficzne locus DYS385 za-

wiera cztery piki zamiast typowych

dwóch. Dodatkowo wysokoœæ/pole

piku dla DYS392 wynosi mniej wiêcej

dwa razy tyle co analogiczna wiel-

Aby u³atwiæ rozró¿nianie

ewentualnej duplikacji locus

od potencjalnej mieszaniny materia³u

od dwóch mê¿czyzn przy wykonywa-

niu badania Y-STR, przedstawiamy

tu kilka zasad opracowanych ad hoc.

Po pierwsze, nale¿y odnotowaæ licz-

bê loci, w których wyst¹pi³o wiêcej al-

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05

PRZEK£ADY

leli. Im wiêksza liczba loci z wiêcej ni¿

jednym allelem, z wyj¹tkiem uk³adu

DYS385a/b, tym wiêksze prawdopo-

dobieñstwo, ¿e w próbce wystêpuje

mieszanina materia³u od kilku mê¿-

czyzn.

Po drugie, je¿eli wiêcej alleli wy-

stêpuje w wiêcej ni¿ jednym locus,

nale¿y ustaliæ, czy te loci s¹ zlokali-

zowane blisko siebie na chromoso-

mie Y, pos³uguj¹c siê informacjami

na temat wzglêdnej pozycji Y-STR,

np. zawartych w tabeli 2. Je¿eli do-

mniemane zduplikowane loci s¹ bli-

sko siebie (np. <1 Mb), wówczas ca-

³y odcinek chromosomu Y móg³ zo-

staæ zduplikowany kiedyœ w przesz³o-

œci i obecnie ma rozbie¿ne allele. Im

wanych za pomoc¹ primerów specy-

ficznych dla locus, aby sprawdziæ,

czy któreœ loci posiadaj¹ allele ró¿-

ni¹ce siê o wiêcej ni¿ jedn¹ jednost-

kê powtórzeñ. Duplikacje zazwyczaj

s¹ w odleg³oœci wiêkszej ni¿ jedno

powtórzenie, iloœæ produktu PCR dla

alleli jest podobna (np. DYS537 alle-

le 14 i 15), podczas gdy mieszaniny

najprawdopodobniej bêd¹ mia³y jed-

no albo wiêcej loci o rozstrzeleniu

wiêkszym ni¿ jedna jednostka powtó-

rzenia (np. DYS437 allele 14 i 16).

Je¿eli przyjrzymy siê odleg³oœciom

alleli dla duplikowanych loci w tabeli

1, dojdziemy do wniosku, ¿e wiêk-

szoœæ alleli dzieli jedna jednostka po-

wtórzeñ. Wreszcie nale¿y zbadaæ

duplikacja musi wyst¹piæ u prawdzi-

wego sprawcy. Dlatego przypadki du-

plikacji takie jak opisane w tym opra-

cowaniu nie powinny wywo³ywaæ nie-

pokoju w kontekœcie badañ kryminali-

stycznych wykonywanych przy u¿y-

ciu markerów Y-STR. Celem autorów

jest zademonstrowanie, ¿e w próbce

zawieraj¹cej materia³ od jednej oso-

by mog¹ wyst¹piæ wielokrotne dupli-

kacje i dlatego nie nale¿y formu³owaæ

pochopnych wniosków co do liczby

dawców, kiedy w locus o pojedynczej

kopii zaobserwuje siê wiêcej ni¿ je-

den allel o równej intensywnoœci.

Duplikacja locus na chromosomie

Y jest pod wieloma wzglêdami analo-

giczna do heteroplazmii w DNA mito-

chondrialnym, co w zale¿noœci od

okolicznoœci mo¿e przyczyniæ siê do

zwiêkszenia „si³y” zgodnoœci miêdzy

dwiema próbkami. Opisane zjawisko

duplikacji loci nie powinno uniemo¿li-

wiaæ wiarygodnej interpretacji, cho-

cia¿ mo¿e utrudniæ wyjaœnianie wyni-

ków w s¹dzie. Specyficzny dla osob-

ników mêskich chromosom Y jest

u¿ytecznym narzêdziem wspomaga-

j¹cym identyfikacjê, choæ mo¿e siê

ona okazaæ bardziej z³o¿ona, ni¿ po-

cz¹tkowo s¹dzono.

Przegl¹d literatury

zawieraj¹cej doniesienia

na temat duplikacji Y-STR

Ryc. 4. Elektroferogram PowerPlex Y dla mieszaniny materia³u od 2 mê¿czyzn. W zaznaczonych loci

jest widocznych wiele alleli, które s¹ oddzielone wiêcej ni¿ jedn¹ jednostk¹ powtórzenia. Oprócz tego

wysoce polimorficzne locus DYS385 ma cztery allele zamiast normalnych dwóch. Warunki zgodne z

opisem w czêœci „Materia³y i Metody” dla 1 ng DNA i wykrywaniem na ABI 3100.

Autorzy dokonali przegl¹du ok.

200 publikacji, zawieraj¹cych infor-

macje na temat populacji haplotypo-

wej Y-STR. Opracowania pochodz¹

ze zbioru literatury na temat STR

znajduj¹cego siê pod adresem

http://www.cstl.nist.gov/biotech/strba-

se/str_ref.htm. Czêœæ wyników stu-

diów populacyjnych mo¿na znaleŸæ

w Y-STR Haplotype Reference Data-

base (YHRD; http://yhrd.org, wcze-

œniej www.ystr.org.

bardziej domniemane zduplikowane

loci s¹ oddalone od siebie na chro-

mosomie Y (np. DYS19 i DYS438,

które znajduj¹ siê na ró¿nych ramio-

nach chromosomu Y), tym bardziej

prawdopodobne jest to, ¿e próbka

zawieraj¹ca wiele alleli w wielu loci

jest mieszanin¹.

Po trzecie, nale¿y zbadaæ odle-

g³oœæ wielokrotnych alleli amplifiko-

DYS385 i sprawdziæ, czy to wysoce

polimorficzne locus posiada wiêcej

ni¿ dwa allele. Je¿eli tak, i spe³nione

s¹ inne kryteria dla mieszaniny, ist-

nieje wówczas wiêksze prawdopodo-

bieñstwo, ¿e mamy do czynienia

z mieszanin¹ ni¿ duplikacj¹ locus.

Oczywiœcie je¿eli œlad dowodowy

zawiera materia³ z jednego Ÿród³a,

w którym wykryto duplikacjê, ta sama

oprac. Ewa Nogacka

PROBLEMY KRYMINALISTYKI 250/05

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: