Wykład z genetyki sadowej.doc

17 stycznia 2007 r.

Analiza DNA znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach. Należą do nich przede wszystkim diagno­styka medyczna (transplantologia, diagnostyka prenatalna chorób dziedzicznych itp.), medycyna są­dowa (ustalanie pokrewieństwa, badania identyfikacyjne) i kryminalistyka. Jest również niezbędna w takich dziedzinach jak: mapowanie genetyczne, antropologia, genetyka populacyjna, biologia ewolu­cyjna, hodowla roślin i zwierząt, systematyka itd.

Z historii badań DNA:

1902 r.              odkrycie układu antygenów grupowych krwi AB0 (Landsteiner, Richter)

1958 r.              opisanie układu antygenów zgodności tkankowej HLA

1970 r.              początek trawienia DNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych (Arber, Nathans, Smith)

1975 r.              technika transferu i hybrydyzacji DNA (Southern)

1977 r.              technika sekwencjonowania (Sanger, Maxam, Gilbert)

1978–80 r.              koncepcja metody RFLP (Salomon, Bodner, Batstein)

1981 r.              zsekwencjonowanie mtDNA (Anderson)

1983 r.              opracowanie techniki PCR (Saiki, Mullis)

1985 r.              opisanie polimorfizmu sekwencji minisatelitarnych (VNTR), sondy multilokusowe, tech­nika „DNA fingerprinting”(Jeffreys)

1987 r.              sondy jednolokusowe (Wong, Nakamura)

1991 r.              opisanie polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych (STR)

1993 r.              rutynowe badania DNA w ponad trzydziestu krajach

2001 r.              opisanie polimorfizmu  pojedynczych nukleotydów (SNP)

DNA jako dowód w sądzie:

1985 r.              pierwszy dowód z badań DNA w sprawie imigracyjnej

1987 r.              pierwszy dowód w sprawie o morderstwo w Wielkiej Brytanii

1988 r.              dowód w sprawie o morderstwo i gwałt w USA

1994 r.              pierwsza formalna baza danych DNA – CODIS

2001 r.              pierwszy dowód sądowy z badań DNA mitochodrialnego

Informacja genetyczna komórki. Modele dziedziczenia

Całość informacji genetycznej komórki podzielona jest pomiędzy genom jądrowy i mitochondrialny.

Genom jądrowy obejmuje 3×109 pz. Sekwencje kodujące, czyli geny, których liczba szacowana jest na ok. 30 tysięcy, stanowią tylko ok. 20% genomu. Pozostałe 80% stanowią sekwencje niekodujące.
O polimorfizmie DNA jądrowego stanowią:

–        tandemowe sekwencje repetytywne (20–30% wszystkich sekwencji niekodujących);

–        zmienność pojedynczych nukleotydów (p. niżej).

DNA mitochondrialny (mtDNA) jest kolistą czą­steczką, zawierającą jedynie 16 579 pz, w tym 37 ge­nów. Źródłem zmienności są dwa regiony zawierające sekwen­cje nieko­dujące: HV1 i HV2, liczące w sumie 1200 pz. Region HV1, leżący pomiędzy 16024. a 16365. parą nu­kleoty­dów, zawiera 50 loci SNP. Region HV2 leży po­między 73. a 340. parą nukleotydów i obejmuje 28 loci SNP. W tych dwóch regionach poszukuje się zmienności mtDNA.

Dziedziczenie informacji genetycznej zawartej w genomie jądrowym odbywa się zgodnie z prawami Mendla. Według prawa czystości gamet (I prawo Mendla) każda gameta wytwarzana przez organizm posiada tylko jeden gen z danej pary alleli. Prawo niezależnej segregacji cech (II prawo Mendla) mówi, że geny należące do dwóch różnych par alleli są rozdzielane do gamet niezależnie od siebie. Prawa te nie dotyczą DNA mitochondrialnego, które nie rekombinuje, lecz dziedziczy się wyłącznie z linii matczynej.

Wyróżniamy dwa typy zmienności dziedzicznej:

1. zmienność rekombinacyjna → tworzenie nowych układów istniejących już alleli na skutek róż­nych kombinacji cech rodzicielskich i wymiany homologicznych fragmentów DNA (tylko ge­nom jądrowy);
2. zmienność mutacyjna → tworzenie nowej informacji genetycznej; nagłe, skokowe zmiany przeka­zywane potomstwu, powstające na skutek tranzycji, insercji, delecji lub mutacji punkto­wych (genom jądrowy i mitochondrialny).

Rodzaje polimorfizmu DNA:

1. Polimorfizm pojedynczych nukleotydów (Single Nucleotide Polymorphism, SNP).

SNP oznacza utrwalone mu­tacje punktowe występujące z częstością min. 1%. Polimorfizm w obrę­bie jednego locus jest bardzo mały, gdyż obejmuje tylko trzy możliwości (np. homozygota AA, homozygota GG, heterozygota AG). Niską zmienność rekompensuje jednak bardzo duża ilość miejsc zmiennych. Mutacja punktowa przy­pada średnio raz na każde 1000 pz, nie wyłą­czając sekwencji kodujących. Wielka liczba loci jest źró­dłem olbrzymiej zmienności, rozłożo­nej równomiernie w całym genomie, co czyni metodę SNP szczególnie wartościową w przy­padku badania DNA zdegradowanego, niemożliwego do oceny in­nymi metodami. Przykładami SNP są m.in. polimorfizm układów grupowych krwi, lekowrażliwość, a także niektóre choroby genetycznie uwarunkowane (np. mukowiscydoza, fenyloketonuria, achondro­plazja, hemofilia A, anemia sierpowatokrwinkowa itd.).

2. Polimorfizm DNA satelitarnego (krótkich sekwencji tandemowych).

Mianem DNA satelitarnego określa się zespoły sekwencji powtórzonych, ułożonych jedna za drugą (tandemowo). DNA satelitarny dzieli się na minisatelitarny (Variable Number of Tandem Repeats, VNTR) i mikrosatelitarny (Short Tandem Repeats, STR). Różnice między nimi przed­stawia tabela:

Polimorfizm SNP a polimorfizm VNTR:

SNP

VNTR

Metody wykrywania polimorfizmu DNA:

1. ANALIZA RESTRYKCYJNA ( = analiza długości fragmentów restrykcyjnych, Restriction Fragments Length Polymorphism, RFLP):

a.       analiza pojedynczego locus (Single Locus Probes, SLP) → PROFIL;

b.      jednoczesna analiza wielu loci (Multiple Locus Probes, MLP) → FINGER­PRINT.

W metodzie tej wykorzystuje się trawienie DNA za pomocą  enzymów restrykcyjnych, czyli enzymów bakteryjnych przecinających nić w ściśle określonym miejscu. Kolejne etapy metody to: elektroforetyczny rozdział pociętego DNA, denaturacja DNA w alkalicznym roztworze, transfer metodą Southerna na nylonową (nitrocelulozową) membranę i hybrydyzacja ze specy­ficznymi sondami. Wystarczy zmiana pojedynczego nukleotydu w sekwencji rozpoznawanej przez enzym, aby nie był on w stanie przeciąć DNA. Spowoduje to zmianę liczby powstałych fragmentów DNA (produktów rozkładu pierwotnej cząsteczki) oraz ich wielkości. Jedno i dru­gie ujawnia rozdział elektroforetyczny.

2. ENZYMATYCZNA AMPLIFIKACJA (reakcja łańcuchowa polimerazy, Polymerase Chain Re­action, PCR):

a.       polimorfizm DNA mikrosatelitarnego (STR);

b.      polimorfizm pojedynczych nukleotydów (SNP).

Reakcja łańcuchowa polimerazy jest metodą powielania łańcuchów DNA w warunkach labo­ratoryjnych, polegającą na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Do re­akcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery oraz termostabilną polimerazę. Na początku w wysokiej temperaturze (zwykle około 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. Obni­żenie temperatury do optymalnej wartości, ściśle określonej dla danej pary starterów (45–70°C), powoduje ich przyłączenie do matrycy. Ponowne podwyższenie temperatury do około 72°C sprzyja utworzeniu kompleksu między matrycą i starterami a polimerazą DNA, co roz­poczyna syntezę nici komplementarnej do matrycy.

Wielkimi zaletami metody są jej bardzo wysoka czułość oraz wydajność. (Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2n czą­steczek; wy­dajność rzeczywista jest niewiele mniejsza).

Odmianą reakcji PCR jest tzw. PCR w czasie rzeczywistym (Real Time PCR, RT-PCR). Jest to metoda ilościowego oznaczania DNA, pozwalająca na monitorowanie reakcji w czasie, w któ­rym ta reakcja przebiega. RT-PCR wymaga termocyklera z odpowiednim systemem biolo­gicz­nym, specjalnie zaprogramowanych sond oraz dodania barwników fluorescencyjnych in­korpo­rujących podwójną nić DNA (np. bromku etydyny). Monitorowanie zmian w stężeniu pro­duktu następuje poprzez pomiar fluorescencji proporcjonalnej do ilości produktu w miesza­ni­nie.

Inną odmianą jest tzw. multiplex PCR (MPCR), która polega na równoczesnej amplifikacji dwóch lub większej liczby (do 16) markerów genetycznych w jednej mieszaninie reakcyjnej...