biochemia 1 - sprawozdanie A.pdf
(
137 KB
)
Pobierz
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 1 z 5
Data zajęć: 2008/03/27
Sprawozdanie 3.
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie A
Wyznaczenie stałej Michaelisa
i szybkości maksymalnej
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Wstęp
Kataliza enzymatyczna zajmuje się badaniem zależności szybkości reakcji chemicznej
od specyficzności enzymu do substratu (właściwie do stanu przejściowego) oraz ich
stężeniami. Do opisu kinetyki enzymatycznej używa się modelu składającego się z szeregu
reakcji: enzym oddziałuje z substratem; powstaje kompleks enzym-substrat; substrat jest
przekształcany w produkt; końcowym etapem jest odszczepienie produktu od enzymu.
Uwolniony enzym może katalizować kolejną reakcję chemiczną.
Przyjmując założenia: nieodwracalność procesu (z produktów nie powstają substraty);
stężenie początkowe enzymu jest dużo mniejsze niż początkowe stężenie substratu;
nie zmienia się w czasie stężenie kompleksu enzym-substrat (przybliżenie stanu stacjonarnego).
Wtedy spełnione jest:
Równanie Michaelisa-Menten
·
(1)
gdzie:
oznacza stężenie substratu
oznacza szybkość reakcji,
oznacza szybkość takiej reakcji, w której cały enzym jest związany z substratem,
oznacza takie stężenie substratu przy, którym szybkość reakcji osiąga połowę
swojej szybkości maksymalnej, stała Michaelisa.
Celem doświadczenia jest wyznaczanie stałej Michaelisa oraz szybkości maksymalnej reakcji
katalizowanej przez kwaśną fosfatazę.
Kwaśna fosfataza jest enzymem katalizującym rozkład fosforanów organicznych osiągającym
największą aktywność w kwaśnym pH. Należy do enzymów klasy hydrolaz. Obecna jest
w lizosomach komórek. W przeprowadzanym doświadczeniu zachodzi reakcja:
O
-
O
-
OH
N
+
N
+
fosfotaza
+
+
H
2
O
O
H
P
OH
O
O
O
OH
H
P
OH
O
Przygotowano próbki z różnymi stężeniem substratu, którym jest p-nitrofenylofosforan.
Dodano identyczną ilość enzymu do każdej probówki i inkubowano przez taki sam czas.
Reakcję przerwano alkalizując roztwór przez dodanie NaOH. Stężenie produktu, którym jest
p-nitrofenol, wyznaczano przez pomiar absorbancji próbek przy długości fali 410 nm.
Porównywano szybkość reakcji enzymatycznej ze stężeniami substratów.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 2 z 5
Data zajęć: 2008/03/27
Sprawozdanie 3.
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie A
Wyznaczenie stałej Michaelisa
i szybkości maksymalnej
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Materiały
a)
Odczynniki:
roztwór p-nitrofenylofosforanu – substrat,
roztwór fosfatazy w buforze – enzym,
roztwór p-nitrofenolu w buforze – produkt,
0,5 M wodorotlenek sodowy,
0,25 M bufor octanowy o pH 5,0.
b)
Szkło laboratoryjne:
pipety: 0,2 ml (5 szt.), 1 ml (5 szt.), 2 ml (5 szt.), 5 ml (2 szt.),
pipety pełne 2 ml (3 szt.),
zlewki 100 ml i 400 ml,
probówki chemiczne (30 szt.).
c)
Aparatura:
fotokolorymetr „Specol”; kuwety szklane do „Specola” (2 szt.),
statywy do probówek (2 szt.),
łaźnia wodna o temperaturze 37°C,
bibuła, lignina, tryskawka.
Wykonanie
Ćwiczenie przeprowadzono zasadniczo zgodnie z treścią instrukcji „A”. Wydłużono czas
inkubacji, reakcji enzymatycznej, z 25 minut do 31 minut.
1.
Wzięto 200 μl p-nitrofenolu i rozcieńczono do 10 ml buforem octowym.
2.
Przygotowano 8 probówek zgodnie z tabelą 1.
3.
Zmierzono absorpcję próbek dla fali długości 410 nm.
4.
Przygotowano 21 probówek dodając odpowiednie ilości buforu i substratu zgodnie z tabelą 2.
5.
Inkubowano wstępnie probówki przez 5 minut w temperaturze 37°C.
6.
Do probówek od 1 do 11 dodano 0,1 ml roztworu fosfatazy.
7.
Inkubowano probówki przez 31 minut w temperaturze 37°C.
8.
Dodano po 2 ml roztworu NaOH do każdej probówki.
9.
Zmierzono absorpcję próbek dla fali długości 410 nm.
Wyniki
Tabela 1. – Absorpcja p-nitrofenolu
probówka
bufor
p-nitrofenol*
NaOH
A
410
/nr/
/ml/
/ml/
/μmol/
/ml/
1
1,70
0,20
0,020
2,00
0,055
2
1,50
0,40
0,040
2,00
0,110
3
1,30
0,60
0,060
2,00
0,140
4
1,10
0,80
0,080
2,00
0,225
5
0,90
1,00
0,100
2,00
0,255
6
0,70
1,20
0,120
2,00
0,350
7
0,50
1,40
0,140
2,00
0,430
8
1,90
0,00
0,000
2,00
0,000
5 mM
200 µl
10 ml
* stężenie początkowe wynosi
, rozcieńczono
do
, nowe stężenie wynosi:
200 µl
10 ml
· 5 mM 0,1 mM
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 3 z 5
Data zajęć: 2008/03/27
Sprawozdanie 3.
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie A
Wyznaczenie stałej Michaelisa
i szybkości maksymalnej
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Wykres 1. – Krzywa standardowa p-nitrofenolu
0,50
0,45
0,40
A = 2,85 ∙ n
0,35
0,30
A
410
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
n /μmol/
Tabela 2. – Zawartość próbek
probówka
bufor
substrat enzym NaOH
A
410
ΔA
410
/nr/
/ml/
/ml/
/ml/
/ml/
/kor/
1
1,75
0,05
0,10
2,00
0,060 0,060
1’
1,85
0,05
-
2,00
0,000 -
2
1,70
0,10
0,10
2,00
0,130 0,130
2’
1,80
0,10
-
2,00
0,000 -
3
1,65
0,15
0,10
2,00
0,180 0,170
3’
1,75
0,15
-
2,00
0,010 -
4
1,60
0,20
0,10
2,00
0,210 0,200
4’
1,70
0,20
-
2,00
0,010 -
5
1,50
0,30
0,10
2,00
0,305 0,295
5’
1,60
0,30
-
2,00
0,010 -
6
1,35
0,45
0,10
2,00
0,360 0,345
6’
1,45
0,45
-
2,00
0,015 -
7
1,20
0,60
0,10
2,00
0,420 0,420
7’
1,30
0,60
-
2,00
0,000 -
8
1,05
0,75
0,10
2,00
0,460 0,455
8’
1,15
0,75
-
2,00
0,005 -
9
0,80
1,00
0,10
2,00
0,485 0,475
9’
0,90
1,00
-
2,00
0,010 -
10
0,50
1,30
0,10
2,00
0,510 0,495
10’
0,60
1,30
-
2,00
0,015 -
11
1,80
-
0,10
2,00
0,000 -
Czas reakcji wynosił 31 minut.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 4 z 5
Data zajęć: 2008/03/27
Sprawozdanie 3.
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie A
Wyznaczenie stałej Michaelisa
i szybkości maksymalnej
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Tabela 3. – Stężenia w próbkach po reakcji
1,90 ml
Objętość jednej próbki:
5 mM
Stężenie p-nitrofenylofosforanu:
0,08
m
ml
Stężenie fosfatazy (białka) w mieszaninie reakcyjnej:
Stężenie podstawowe fosfatazy:
0,08
m
ml
· 0,10 ml
1,90 ml
·
4,21 · 10
mg
ml
probówka ΔA
410
S**
1/S
v***
v
c
v
sp
****
1/v
sp
µM
1
µmol
µmol
µmol
mg · min
mg · min
µmol
nr
/kor/
µM
31 min
1 min
1
0,060
131,58 0,00760
0,02105 0,00068
0,085
11,780
2
0,130
263,16 0,00380
0,04561 0,00147
0,184
5,437
3
0,170
394,74 0,00253
0,05965 0,00192
0,241
4,158
4
0,200
526,32 0,00190
0,07018 0,00226
0,283
3,534
5
0,295
789,47 0,00127
0,10351 0,00334
0,417
2,396
6
0,345 1184,21 0,00084
0,12105 0,00390
0,488
2,049
7
0,420 1578,95 0,00063
0,14737 0,00475
0,594
1,683
8
0,455 1973,68 0,00051
0,15965 0,00515
0,644
1,553
9
0,475 2631,58 0,00038
0,16667 0,00538
0,672
1,488
10
0,495 3421,05 0,00029
0,17368 0,00560
0,700
1,428
p-nitrofenylofosforanu w próbce wynosi:
** stężenie
mM ·
ml
5 ·
1,90
mM 2,6316 · 10
·
µM
ml
to objętość dodanego substratu [Tabela 2.]
*** ilość powstałych
gdzie
moli p-nitrofenolu obliczono z krzywej standardowej [Wykres 1.]
2,85 ·
0,3509 ·
**** ilość mikromoli produktu podstałego w ciągu 1 minuty (szybkość reakcji) na 1 mg białka:
0,08
m
ml
· 0,10 ml
0,008 mg
Wykres 2. – Zależność ilości produktu v
sp
od stężenia początkowego substratu S
0,8
0,7
0,6
0,5
v
sp
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
[S] /μM/
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 5 z 5
Data zajęć: 2008/03/27
Sprawozdanie 3.
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Ćwiczenie A
Wyznaczenie stałej Michaelisa
i szybkości maksymalnej
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Wykres 3. – wykres Lineweavera-Burka
14,0
(1/v
sp
) = 1398,5 ∙ (1/[S]) + 0,7876
12,0
10,0
8,0
1/v
sp
6,0
4,0
2,0
0,0
-2,0
-0,002
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
1/[S]
Przekształcając wzór (1):
·
·
1
·
1
·
Otrzymano:
1
1
Z wykresu 3. otrzymano:
1
·
1398,5
0,7876
Więc:
1
0,7876
1,270
µmol
mg · min
1398,5
0,7876
1776,7
µM
Wnioski
Zauważono, że szybkość katalizowanej reakcji zależy nieliniowo od stężenia substratu
[Wykres 2.]. Krzywa ma charakter wysyceniowy. Istnieje maksymalna szybkość reakcji.
Odpowiadania ona stanowi maksymalnego wysycenia enzymu przez substrat. Wyznaczono,
że
1,270
µ
·
.
Wykreślono zależność odwrotności szybkości katalizowanej reakcji od odwrotności stężenia
substratu [Wykres 3.]. Zależność ma charakter liniowy, co dowodzi prawdziwości założeń
przyjętych we wstępie. Zachodzi wzór (1). Wyznaczono, że
1776,7 µM
. Stała Michaelisa
jest miarą powinowactwa enzymu do substratu. Im stała Michaelisa jest mniejsza, tym
powinowactwo jest większe.
Wodorotlenek sodu dezaktywuje fosfatazę. W zasadowym pH enzym ulega denaturacji.
Plik z chomika:
biotech_pwr
Inne pliki z tego folderu:
biochemia 1 - sprawozdanie A.pdf
(137 KB)
biochemia 1 - sprawozdanie B.pdf
(123 KB)
biochemia 1 - sprawozdanie D.pdf
(89 KB)
biochemia 1 - sprawozdanie E.pdf
(105 KB)
biochemia 1 - sprawozdanie G.pdf
(103 KB)
Inne foldery tego chomika:
Biochemia - sprawozdania inne
E (moje)
H (moje)
Instrukcje
O (moje)
Zgłoś jeśli
naruszono regulamin