TECHNIKA WESTERN BLOT.pdf

TECHNIKA WESTERN BLOT

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab3.html

TECHIKA WESTER BLOT

(białkoprzeciwciało) wiązanie przeciwciała w celu identyfikacji określonego białka.

Etapy :

1. Przygotowanie ekstraktów komórkowych.

Metody stosowane przy izolacji i oczyszczaniu białek są bardzo różnorodne a ich

wybór zależy od właściwości danego białka.

2. Rozdział białek w żelach poliakrylamidowych. W zależności od zastosowanego

układu można uzyskać rozdział polipeptydów stosownie do różnych właściwości

fizykochemicznych. Przyjmuje się , że elektroforeza w obecności SDS

(dodecylosiarczan sodowy) detergent frakcjonuje białka zależnie od ich masy czyli

zarazem długości łańcucha polipeptydowego. Eliminuje efekt różnicowania pod

1 z 3

2010-04-04 13:27

TECHNIKA WESTERN BLOT

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab3.html

względem kształtu. SDS powoduje denaturację białka , dysocjację podjednostek

(rozbija wiązania niekowalencyjne) i opłaszczenie. Około1,4 gr SDS wiąże się z 1 gr

białka. Ten typ elektroforezy jest najczęściej stosowany i może być użyty jako

metoda analityczna lub stanowić element szeregu dalszych badań. Złożem , w którym

następuje rozdział jest żel poliakrylamidowy. Z reguły do rozdziału białek używana

jest szczególna wersja elektroforezy tzw. elektroforeza nieciągła , która umożliwia

maksymalne wykorzystanie zdolności rozdzielczych tej metody. W praktyce oznacza

to , że zarówno żel składa się jakby z dwóch warstw (żel rozdzielający i zatężający

różniące się składem procentowym) jak również bufor do elektroforezy inny jest w

górnym inny w dolnym zbiorniku aparatu do elektroforezy . Próbki nakładane na żel

mogą mieć stosunkowo dużą objętość ponieważ w czasie przechodzenia przez górną

warstwę żelu zostają zagęszczone do wąskiego pasma aby w dolnym żelu ulec

rozdzieleniu na pojedyncze , ostre prążki. Dzięki temu , że frakcjonowanie zachodzi w

zależności od długości łańcucha polipeptydowego jesteśmy w stanie ustalić masę

cząsteczkową danego białka przez porównywanie z odpowiednimi standardami o

znanych masach , z dokładnością do 510%.

3. Renaturacja.

Inkubacja z odpowiednim buforem.

4. Transfer białek z żelu na membranę nitrocelulozową.

Z reguły elektrotransfer.

5. Immunoblotting.

Jednym z niebezpieczeństw jest to , że białka zaadsorbowane do nitrocelulozy mogą

mieć nieco zmieniony układ przestrzenny aminokwasów a ponieważ rozdzielane są w

żelu w formie zdenaturowanej a następnie muszą ulec renaturacji , mogą w ogóle nie

przyjmować swojej natywnej postaci.

a. Zablokowanie miejsc niespecyficznych.

b. Inkubacja ze specyficznymi dla poszukiwanego białka przeciwciałami.

c. Inkubacja z odczynnikiem używanym do detekcji.

Najczęściej są to II (drugorzędowe) przeciwciała czyli przeciwciała , dla których

antygenem jest przeciwciało specyficzne. II przeciwciała związane są z barwnikami

fluorescencyjnymi , cząstkami złota lub enzymami. Systemy detekcyjne muszą być

proste i czułe. Można wykryć za ich pomocą nawet 10 -9 do 10 -12 gr białka. II

przeciwciała mogą być skoniugowane z enzymem , który zmienia kolor substratu

podczas reakcji np. z AP alkaliczną fosfatazą (w zależności od użytego substratu

utworzony związek jest ciemno niebieski lub purpurowy) lub z HRP peroksydazą

szczurzą (utlenienie odpowiednich substratów prowadzi do powstawania ciemnego

strątu w miejscu reakcji). Innym systemem detekcji jest awidyna lub streptawidyna

skoniugowana z enzymem (AP lub HRP). Awidyna i streptawidyna silnie wiążą się z

biotyną. I przeciwciała znakuje się biotyną a zamiast II przeciwciał do detekcji używa

się awidyny lub streptawidyny skoniugowanej z enzymem. Ponieważ jedna

cząsteczka awidyny lub streptawidyny związana jest z kilkoma cząsteczkami enzymu

system detekcji jest bardziej czuły niż w przypadku użycia przeciwciał.

Następny system to tzw. system NIP. Stworzony aby ograniczyć ilość

niespecyficznych reakcji II przeciwciał. I przeciwciała znakuje się nitrojodofenolem

(NIP) , II przeciwciała skoniugowane z enzymem są skierowane przeciwko NIP.

Ponieważ NIP jest związkiem drobnocząsteczkowym reakcja przeciwciał jest bardzo

specyficzna. Kolejny rodzaj to systemy nieenzymatyczne. Na przykład II przeciwciała

2 z 3

2010-04-04 13:27

TECHNIKA WESTERN BLOT

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab3.html

wyznakowane koloidalnym złotem lub radioaktywnie ( 125 I). W pierwszym przypadku

uzyskuje się bezpośrednie uwidocznienie reakcji , w drugim detekcja wymaga

autoradiografii.

TECHNIKA NORTHERN

ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU

3 z 3

2010-04-04 13:27

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: