Transformacja.docx

Transformacja-zmiana fenotypu org. przez wprowadzenie obcego DNA do jego genomu; zmiana genetycznych właściwości komórki (org.) spowodowana pobraniem DNA wyizolowanego z innej komórki i włączeniem go do aparatu genetycznego. Metody transformacji -bezwektorowe: elektroporacja (tranformacja protoplastów), PEG (-=- protoplastów) –glikol polietylenowy, mikrowstrzeliwanie „genegun”, mikroiniekcja (strzykawką), wytrząsanie zawiesiny kom. z włóknami szkanymi, wprowadzenie przez liposomy na zasadzie endocytozy; -wektorowe: Agrobacterium tumefaciens-gramm(-), wolnożyjąca bakteria glebowa, polifag, wywołuje raka szyjki korzeniowej, infekuje roś. jedno i dwuliścienne np. Asparagus, Plazmid Ti. A. rhizogenes-gramm(-), powoduje powst. dużej liczy włośników, Plazmid Ri.

PLAZMID TI-tumor inducting plazmid, ok.200 kpz, wyst. w kom. w ilości kopii 1-2, replikuje niezależnie od chromosomu bakt., przenoszony między kom. Agrobacterium przez koniugację T-DNA-obszar przenoszony do komórek roś. w postaci ssDNA, wyznaczony przez specyficzne 25 nukleotydowych sekwencji granicznych LB i RB, geny tego obszaru nie ulegają ekspresji w kom. bakterii. Znajdują się tam: geny syntezy opin, geny syntezy auksyn i cytokinin. Opiny-pochodne aminokwasów głownie argininy, źródło C i N. 3 klasy Opin: oktopina, nopalina, agropina. Onkogeny-synteza fitohormonów(auksyn,IaaM,IaaH,cytokinin).Wprowadzenie DNA do komórki Agrobac: klonowanie i modyfikacja DNA w plazmidach E.coli, plazmid z genem przenoszony do Agrobac za pomocą koniugacji lub rekombinacji homologicznej.Konstrukcja integrowanego DNA-organizacja i orientacja sekwencji (trans genu)zależy od zmian jakich się oczekuje(nadrepresja,represja,ekspresja środ), zawiera frag. genów różnych org. i tworzy się je poprzez cięcie specyficznymi enzymami restrykcyjnymi i ligację. Budowa konstrukcji genomowej- Promotory-sekwencje DNA nieodczytywane, syg. gdzie zacząć odczytywanie kodu, do nich przyłącza się ważne białko enz.-polimeraza RNA syntetyzujące mRNA. Terminatory-sekwencje DNA nieodczytywane, dają znak polimerazie, w którym miejscu ma zakończyć transkrypcję. Enzymy restrykcyjne-każdy enzym rozpoznaje 1 sekwencję nukleotydową np.GAATTC. Ekspresja konstytutywna-zachodzi na podonym poziomie we wszystkich kom.org., w przeciwieństwie do ekspresji tkankowo-specyficznej. 2 geny do obszaru T-DNA-2 wektory-wek.kointegracyjne-sekwencje wprowadzane do genomu są na tym samym plazmidzie co geny Vir (wirulencji); wek.binarne-na róznych plazmidach-plazmid rozbrojony z genami Vir i plazmid binarny z sekwencjami wprowadzanymi do kom.roślinnych.

Przygotowywanie pożywek: 1.dla bakterii, 2.dla roślin (regeneracyjne, selekcyjne z antybiotykami-antybiotyki wrażliwe na temp., sterylizujemy przez filtrowanie). Otrzymywanie roślin do transformacji: sterylizacja i wysiew nasion,dobrać najbardziej właściwe warunki sterylizacji, stężenie i rodzaj,czas działania subst. sterylizującej, podchloryn-w celu lepszej penetracji czynnika sterylizującego,moczenie w alk.etylowym,dodanie detergentu. Kiełkowanie: nasiona po steryl. na płyki Petriego lub słoiki na pożywki ukorz. Wzrost siewek w fitotronie- kontrol. warunki. Prekultura (kondycjonowanie)-zwiększenie kompetencji do regeneracji i transformacji, stres z uszkodzenia tkanek nie nakłada się na stres z kokultury, nie zawsze korzystne. Cięcie eksplantatów: materiał rośl-fragment organu, z liści najczęściej, 5x5 mm, na szalce w poż.MS. Przygotowanie Agrobacterium: pasaż na płytkach z poż.YEB i prowadzimy hod.w 28°C, po 2 dniach zakładamy płynną kulturębak., wirujemy je i osad rozpuszczamy w poż.do inokulacji,którą zalejemy eksplantaty; musi mieć odp. gęstość. INOKULACJA-kokultura-eksplantaty zalewa się pożywką z bakteriami, do zranionych powierzchni przyczepia się Agrobac i następuje transfer T-DNA, im dłuższy czas tym większy stres eksplantatu i trudniej wyeliminować bakterie. Eliminacja-płukanie w antybiotykach i dodanie ich do pożywki regen.,mimo podawania antyb. bak. mogą pozostać do końca kultury. Selekcja: stosowana zaraz po zakończeniu ko kultury może zahamować regenerację; powinna wyeliminować lub osłabić kom.jakie nie uległy transformacji, kom.transgeniczne mają aktyw.geny i nie powinne neg. reagować na antybiot. Wybór strategii selekcji zależy od promotora i genu markerowego, reakcji tkanek i sposobu Regeneracji roślin: po 2-3 tyg.pojawia się kallus w miejscach zranień, po 6 pędy, odcinane od kallusa. Ukorzenianie: po zregenerowaniu pędów (ok.9 tyg.)na poż.ukorzeniającą. Rośliny transgeniczne-po 12 tyg. Wsadzanie do ziemi po ok.13 tyg.

Efektywność transformacji-% eksplantatów, z których zregenerowano transgeniczny pęd. Potencjał regeneracyjny-zdoln.kom/org do odtworzenia rośliny, różne gat. i różne części roś.łatwiej/trudniej regenerują,wpływ na niego ma np. czas trwania stresu przy inokulacji czy prekultura, ważny w procesie regeneracji-niezbędy do powstania roś transgenicznych. Gen GFP: odp. za tworzenie białka zielonej fluorescencji, gen reporterowy-stosowany do sprawdzania czy dany organizm po transformacji jest transgeniczny, po oświetleniu światłem I-400 II-475 daje zieloną fluorescencję 509nm,gen pochodzi z meduzy A.Victoria, przeprowadzenie testu z naświetlaniem nie wpływa negat na roś. Produkty transgeniczne: kotlety sojowe z genem tolerancji na herbi; przecier pomidor o przedłużonej trwałości; ryż odporny na choroby wirusowe; sałatka warzywa z warzyw o podwyższ zawart skł.min i witamin; olej słonecznikowy-redukcja obróbki przed sprzedażą

Transformacja-zmiana fenotypu org. przez wprowadzenie obcego DNA do jego genomu; zmiana genetycznych właściwości komórki (org.) spowodowana pobraniem DNA wyizolowanego z innej komórki i włączeniem go do aparatu genetycznego. Metody transformacji -bezwektorowe: elektroporacja (tranformacja protoplastów), PEG (-=- protoplastów) –glikol polietylenowy, mikrowstrzeliwanie „genegun”, mikroiniekcja (strzykawką), wytrząsanie zawiesiny kom. z włóknami szkanymi, wprowadzenie przez liposomy na zasadzie endocytozy; -wektorowe: Agrobacterium tumefaciens-gramm(-), wolnożyjąca bakteria glebowa, polifag, wywołuje raka szyjki korzeniowej, infekuje roś. jedno i dwuliścienne np. Asparagus, Plazmid Ti. A. rhizogenes-gramm(-), powoduje powst. dużej liczy włośników, Plazmid Ri.

PLAZMID TI-tumor inducting plazmid, ok.200 kpz, wyst. w kom. w ilości kopii 1-2, replikuje niezależnie od chromosomu bakt., przenoszony między kom. Agrobacterium przez koniugację T-DNA-obszar przenoszony do komórek roś. w postaci ssDNA, wyznaczony przez specyficzne 25 nukleotydowych sekwencji granicznych LB i RB, geny tego obszaru nie ulegają ekspresji w kom. bakterii. Znajdują się tam: geny syntezy opin, geny syntezy auksyn i cytokinin. Opiny-pochodne aminokwasów głownie argininy, źródło C i N. 3 klasy Opin: oktopina, nopalina, agropina. Onkogeny-synteza fitohormonów(auksyn,IaaM,IaaH,cytokinin).Wprowadzenie DNA do komórki Agrobac: klonowanie i modyfikacja DNA w plazmidach E.coli, plazmid z genem przenoszony do Agrobac za pomocą koniugacji lub rekombinacji homologicznej.Konstrukcja integrowanego DNA-organizacja i orientacja sekwencji (trans genu)zależy od zmian jakich się oczekuje(nadrepresja,represja,ekspresja środ), zawiera frag. genów różnych org. i tworzy się je poprzez cięcie specyficznymi enzymami restrykcyjnymi i ligację. Budowa konstrukcji genomowej- Promotory-sekwencje DNA nieodczytywane, syg. gdzie zacząć odczytywanie kodu, do nich przyłącza się ważne białko enz.-polimeraza RNA syntetyzujące mRNA. Terminatory-sekwencje DNA nieodczytywane, dają znak polimerazie, w którym miejscu ma zakończyć transkrypcję. Enzymy restrykcyjne-każdy enzym rozpoznaje 1 sekwencję nukleotydową np.GAATTC. Ekspresja konstytutywna-zachodzi na podonym poziomie we wszystkich kom.org., w przeciwieństwie do ekspresji tkankowo-specyficznej. 2 geny do obszaru T-DNA-2 wektory-wek.kointegracyjne-sekwencje wprowadzane do genomu są na tym samym plazmidzie co geny Vir (wirulencji); wek.binarne-na róznych plazmidach-plazmid rozbrojony z genami Vir i plazmid binarny z sekwencjami wprowadzanymi do kom.roślinnych.

Przygotowywanie pożywek: 1.dla bakterii, 2.dla roślin (regeneracyjne, selekcyjne z antybiotykami-antybiotyki wrażliwe na temp., sterylizujemy przez filtrowanie). Otrzymywanie roślin do transformacji: sterylizacja i wysiew nasion,dobrać najbardziej właściwe warunki sterylizacji, stężenie i rodzaj,czas działania subst. sterylizującej, podchloryn-w celu lepszej penetracji czynnika sterylizującego,moczenie w alk.etylowym,dodanie detergentu. Kiełkowanie: nasiona po steryl. na płyki Petriego lub słoiki na pożywki ukorz. Wzrost siewek w fitotronie- kontrol. warunki. Prekultura (kondycjonowanie)-zwiększenie kompetencji do regeneracji i transformacji, stres z uszkodzenia tkanek nie nakłada się na stres z kokultury, nie zawsze korzystne. Cięcie eksplantatów: materiał rośl-fragment organu, z liści najczęściej, 5x5 mm, na szalce w poż.MS. Przygotowanie Agrobacterium: pasaż na płytkach z poż.YEB i prowadzimy hod.w 28°C, po 2 dniach zakładamy płynną kulturębak., wirujemy je i osad rozpuszczamy w poż.do inokulacji,którą zalejemy eksplantaty; musi mieć odp. gęstość. INOKULACJA-kokultura-eksplantaty zalewa się pożywką z bakteriami, do zranionych powierzchni przyczepia się Agrobac i następuje transfer T-DNA, im dłuższy czas tym większy stres eksplantatu i trudniej wyeliminować bakterie. Eliminacja-płukanie w antybiotykach i dodanie ich do pożywki regen.,mimo podawania antyb. bak. mogą pozostać do końca kultury. Selekcja: stosowana zaraz po zakończeniu ko kultury może zahamować regenerację; powinna wyeliminować lub osłabić kom.jakie nie uległy transformacji, kom.transgeniczne mają aktyw.geny i nie powinne neg. reagować na antybiot. Wybór strategii selekcji zależy od promotora i genu markerowego, reakcji tkanek i sposobu Regeneracji roślin: po 2-3 tyg.pojawia się kallus w miejscach zranień, po 6 pędy, odcinane od kallusa. Ukorzenianie: po zregenerowaniu pędów (ok.9 tyg.)na poż.ukorzeniającą. Rośliny transgeniczne-po 12 tyg. Wsadzanie do ziemi po ok.13 tyg.

Efektywność transformacji-% eksplantatów, z których zregenerowano transgeniczny pęd. Potencjał regeneracyjny-zdoln.kom/org do odtworzenia rośliny, różne gat. i różne części roś.łatwiej/trudniej regenerują,wpływ na niego ma np. czas trwania stresu przy inokulacji czy prekultura...