seminarium - wydruk 1.doc

(12520 KB) Pobierz

seminarium

18. 12. 2003

F L U O R O F O R Y

1. Wstęp – zjawisko luminescencji

2. Fluorofory

a) najczęściej stosowane fluorofory

b) widma fluorescencji i ich własności

c) podział ogólny fluoroforów

d) fluorofory naturalne

e) sondy fluorescencyjne

f) sondy DNA

3. Zastosowanie fluorescencji pod kątem biologicznym i medycznym

4. Podsumowanie

Joanna Klejna

V fizyka biomedyczna UG

· luminescencja - zjawisko emisji światła przez substancję z elektronowych stanów wzbudzonych; dzieli się na fluorescencję i fosforescencję

Ø fluorescencja – „szybka” luminescencja (związana z bezpośrednim przejściem promienistym ze stanu wzbudzonego do niższego).

Ø fosforescencja – opóźniona luminescencja (przejście przez pośredni stan meta-stabilny).

Ø schemat Jabłońskiego

•S stany singletowe

•T stany trypletowe

•A absorpcja

•F fluorescencja

•P fosforescencja

•IC konwersja wewnętrzna

•ISC konwersja interkombinacyjna

wzbudzone stany oscylacyjne

(wzbudzone stany rotacyjne nie pokazane)

Energia

elektronowy stan podstawowy

Rys. 1. Uproszczony schemat Jabłońskiego

Ø czas życia (τ) fluorescencji - około 10 ns

Ø czas życia fosforescencji – w zakresie od milisekund do sekund (a nawet dużo dłuższe)

· substancje fluoryzujące (fluorofory)

Ø cząstki aromatyczne

chinina fluoresceina rodamina B

kumaryna

POPOP oranż akrydynowy

Rys. 2. Wzory typowych substancji fluoryzujących (barwników, fluoroforów).

Ø fluorescencyjne charakterystyki spektralne

Rys. 3. Widma absorpcji i emisji perylenu i chininy.

· własności widm fluorescencji

Ø przesunięcie Stokesa – widmo fluorescencji jest przesunięte względem widma absorpcji w stronę długofalową; Stokes – 1852

Rys. 4. Doświadczalny układ Stokesa do detekcji przesunięcia Stokesa

Przesunięcie Stokesa jest najsilniejsze dla polarnych fluoroforów w polarnych rozpuszczalnikach

Rys. 5. Widma emisji TNS w wodzie, związanego z „apomyoglobiną”

oraz związanego z DMPC, lipidem

Ø reguła Kashy - widmo emisji nie zależy od długości fali światła wzbudzającego

Ø reguła zwierciadlanej symetrii – zasada zachowania parzystości

Emsja jest zwierciadlanym odbiciem absorpcji tylko przy przejściu ze stanu podstawowego do pierwszego wzbudzonego, nie zaś względem widma absorpcji całkowitej.

Rys. 6. Symetria zwierciadlana i zasada Francka-Condona

Wyjątki od reguły symetrii zwierciadlanej - p-terphenyl, antracen

Rys. 7. Widmo absorpcji (A) i emisji (F) p-terphenylu.

Rys. 8. Widmo emisji antracenu w toluenie zawierającym 0.2 M dwuetyloaniliny.

Krzywa przerywana pokazuje widmo emisji samego antracenu (lewa strona rysunku) oraz jego ekscypleksu z dwuetyloaniliną.

· definicje

Ø wydajność kwantowa jest to stosunek liczby emitowanych fotonów do liczby zaabsorbowanych fotonów; wyraża się wzorem:

, gdzie

Γ jest stałą szybkości emisji fluoroforu

knr - stałą szybkości zaniku bezpromienistego do stanu S0

Wydajność kwantowa może być bliska jedności jeśli stała szybkości zaniku bezpromienistego jest dużo mniejsza od stałej szybkości zaniku promienistego

Ø czas życia - średni czas jaki molekuła spędza w stanie wzbudzonym, zanim wróci do stanu podstawowego; określony jest następująco:

Promienisty (naturalny) czas życia - czas życia fluoroforu w nieobecności procesów bezpromienistych, wyrażony zależnością:

Ø wygaszanie fluorescencji – zmniejszenie natężenia fluorescencji spowodowane różnymi mechanizmami (wygaszanie zderzeniowe, spotkaniowe, statyczne i inne)

Rys. 9. Położenie fluoroforu względem gasiciela (Q - ), jego osiągalność

· fluorofory stosowane w biochemii – podział ogólny

Ø wewnętrzne (właściwe) - występują w stanie naturalnym (NADH, FAD, FMN)

Ø zewnętrzne (niewłaściwe) - dodawane są do próbki nie wykazującej odpowiednich własności spektralnych (DNS-Cl, FITC)

Ø

indykatory fluorescencyjne - fluorofory których własności widmowe dobierane są w zależności od badanych substancji (PBFI)

Rys. 10. Przykład indykatora fluorescencyjnego, PBFI, czułego na potas.

Ø sensory fluorescencyjne – zastosowanie w chemii klinicznej i analitycznej, w badaniach biomedycznych, w immunologii chemicznej – np. do oznaczania poziomu cukru we krwi

Rys. 11. Sensory fluorescencyjne w chemii klinicznej.

· fluorofory naturalne

fosforan

pyridoksaminy

fosforan pyridoksalu

NADH FAD

tryptofan (TRP) tyrozyna (TYR) fenyloalanina (PHE)

Rys. 12. Biochemiczne fluorofory wewnętrzne

Ø fluorescencyjne kofaktory enzymatyczne

Rys. 13. U góry: widma absorpcji i emisji kofaktorów enzymatycznych: NADH i FAD. Na dole po lewej: widmo emisji fosforanu pyridoksaminy (1), fosforanu pyridoksalu (2) i pyridoksalu powiązanego z fosforylazą b jako zasadą Schiffa (3). Na dole po prawej: widmo emisji kolagenu wzbudzonego w 333 nm.

· sondy fluorescencyjne

Ø sondy reagujące z proteinami

Rys. 14. Sondy reagujące w połączeniu z makromolekułami

Ø rola przesunięcia stokesowskiego w znakowaniu protein

Barwniki, które charakteryzują się dużym przesunięciem stokesowskim są dobrym materiałem na sondy fluorescencyjne

Ø sondy wrażliwe na rozpuszczalnik

Ø sondy niekowalencyjnie związane z proteinami –

ANS (1-anilinonaftalene-8-sulfonic acid)

TNS (6-(p-toluidynyl)naftalene-2-sulfonic acid)

Rys 15. Widmo fluorescencji BSA przy wzrastającej koncentracji ANS

Ø sondy w membranach

Znakowanie membran polega na prostym przeniesieniu nierozpuszczalnego w wodzie materiału sondy fluorescencyjnej do niepolarnej fazy membran. DPH jest jednym z najczęściej stosowanych w tym celu związków. Membrany mogą być również znakowane przez bardziej rozpuszczalne w wodzie związki takie jak fluoresceina czy rodamina.

· sondy DNA

Emisja samego DNA jest bardzo słaba i leży daleko w ultrafiolecie, dlatego nie nadaje się do praktycznych badań. Na szczęście istnieje wiele barwników łączących się spontanicznie z DNA i silnie fluoryzujących.