II. 1. Przykładowe molekuły fluoryzujące.
Fluorescencja jest charakterystyczna dla molekuł aromatycznych. Kilka typowych przykładów molekuł substancji fluoryzujących (fluoroforów) pokazano na rysunku 2.1.
chinina fluoresceina
rodamina B POPOP
oranż akrydynowy kumaryna
Rys. 2.1. Wzory typowych substancji fluoryzujących
(barwników, fluoroforów) [1].
Chinina jest stosowana m.in. w toniku. Przy obserwacji szklanki toniku wystawionego na światło słoneczne obserwuje się pod kątem prostym do wzbudzenia niebieskie, powierzchniowe świecenie roztworu. Podczas przejścia do stanu podstawowego zostaje wyemitowane światło w zakresie 450 nm.
To świecenie staje się bardziej zauważalne po dodaniu do toniku mniej polarnego (o mniejszej stałej dielektrycznej) rozpuszczalnika, jakim jest alkohol. Zależność intensywności fluorescencji chininy od polarności rozpuszczalnika jest przykładem tego, jak w sposób nieinwazyjny można badać wpływ otoczenia, środowiska. Pierwsze badania fluorescencji roztworu chininy były przeprowadzone i opublikowane przez Herschela w roku 1845. Na podstawie posiadanej wówczas wiedzy nie można było wytłumaczyć zjawiska fluorescencji chininy.
Fluoresceina i rodamina znalazły zastosowanie w płynach chłodniczych. Ponadto fluoresceina została wykorzystana w roku 1877 do pokazania, że Dunaj i Ren są połączone podziemnymi strumieniami. Do Dunaju wlano fluoresceinę by po 60 godzinach stwierdzić jej obecność w małej rzece dopływającej do Renu (duża czułość fluorescencji na detekcję). Dzisiaj fluoresceina używana jest do lokalizacji na morzach, na przykład podczas lądowania kapsuł kosmicznych na Atlantyku.
Antracen i perylen - służą do monitorowania środowiska (plam rozlanego oleju), POPOP - używany jest w licznikach scyntylacyjnych, akrydyna – w badaniach DNA, kumaryna (umbeliferon) – w badaniach enzymatycznych [1].
II. 2. Podział ogólny fluoroforów.
Fluorofory dzielą się na dwie główne klasy, wewnętrzne (właściwe) i zewnętrzne (niewłaściwe). Fluorofory właściwe to takie, które występują w stanie naturalnym (np. w proteinach – grupa indolowa tryptofanu, NADH, FAD, FMN). Fluorofory zewnętrzne to takie, które dodawane są do próbki nie wykazującej odpowiednich własności spektralnych (np. DPH dodawany do błon, które same z siebie nie wykazują fluorescencji. DPH spontanicznie łączą się z niepolarnymi obszarami błon. A z powodu słabej rozpuszczalności DPH w wodzie i wygaszania fluorescencji DPH przez wodę, emisja jest obserwowana tylko z miejsc, w których DPH jest związane z błoną. Innymi przykładami mogą być: akrydyna, bromek etylu, które wiążąc się z DNA służą do wizualizacji oraz identyfikacji chromosomów; DNS-Cl – chlorek dansylu, FITC – izocyjanina fluoresceiny).
Istnieje również grupa fluoroforów, zwanych indykatorami fluorescencyjnymi. Są to fluorofory których własności widmowe dobierane są w zależności od badanych substancji, np. PBFI. Fluorofor ten ma centralną grupę 4 NH4+, która wiąże K+. Pod wpływem tego kationu natężenie emisji PBFI rośnie, umożliwia to detekcję tego kationu.
Indykatory fluorescencyjne są obecnie wykorzystywane do wskazywania obecności wielu substancji, włączając w to jony Ca 2+ , Mg 2+ , Na 2+ , Cl - a także O2 oraz do wskaźnikowania pH.
Ponadto, obok zastosowań fluorescencji w biochemii i biofizyce, wzrasta liczba zastosowań w analitycznej i klinicznej chemii. Użycie fluorescencji w klinicznej diagnostyce zastępuje stosowanie źródeł radioaktywnych. Użycie metod optycznych eliminuje niebezpieczeństwa związane z zastosowaniem radioaktywności.
Fluorescencja stosowana jest na szereg sposobów w badaniach biomedycznych. Obrazowanie fluorescencyjne żeli stosowane jest do detekcji fragmentów DNA, metoda ta charakteryzuje się dużą czułością i może często zastępować używanie 32P i autoradiografię. Sekwencjonowanie DNA i realizacja projektu zmierzającego do zbadania genomu ludzkiego odbywają się praktycznie przy zastosowaniu znaczników fluorescencyjnych, zamiast radioaktywnych źródeł.
Innym polem aktywności badawczej, przy zastosowaniu fluorescencji, jest chemia kliniczna. Stosowany w tym przypadku indykator, PBFI, znany jest wielu analitykom badającym poziom potasu we krwi.
Znaczniki fluorescencyjne stosowane są w immunologii chemicznej do pomiaru mas cząsteczkowych, małych molekuł stosowanych w pigułkach i dużych makromolekuł antyciał. Znana jest metoda fluorescencyjna oznaczania poziomu cukru w krwi. Obiektem badawczym, próbką, może być ogólnie biorąc krew. Sensor fluorescencyjny może być wprowadzany do próbki z pomocą kapilary. Poziom sensora jest odczytywany z pomocą niekosztownego instrumentu fluorescencyjnego, w którym stosować można diodę świetlną lub wskaźnik laserowy jako źródło światła. Można oczekiwać, że w następnym dziesięcioleciu będą stosowane powszechnie przez lekarzy punktowe wskaźniki fluorescencyjne, a także znajdą się one w powszechnym, domowym, użytku.
A. Fluorofory naturalne.
Naturalne proteiny fluoryzujące (czyli inaczej fluorofory właściwe czy wewnętrzne) wywodzą się z aromatycznych kwasów aminowych – tyrozyny, tryptofanu i fenyloalaniny.
tryptofan tyrozna fenyloalanina
Rys. 2.2.a. Biochemiczne fluorofory wewnętrzne [1].
Tryptofan jest głównych składnikiem białek produktów żywnościowych. Aminokwas ten przede wszystkim jest używany przez mózg do produkcji serotoniny i melatoniny, neuroprzekaźników potrzebnych do przenoszenia impulsów nerwowych z jednej komórki do innej. Jego grupy indolowe (C8H7N) są dominującym źródłem absorbcji promieniowania UV i emisji w proteinach. Emisja tryptofanu jest najbardziej wrażliwa na lokalne otoczenie, tryptofan jest więc najczęściej stosowany celem dostarczania informacji o konformacyjnych zmianach protein. Tyrozyna przekształcana jest przez organizm w dopaminę i noradrenalinę, które również przekazują bodźce synapsom. W natywnych proteinach emisja tyrozyny jest często wygaszana, być może wskutek wzajemnego oddziaływania z łańcuchem peptydowym albo wskutek bezpromienistego przenoszenia energii do tryptofanu. Fenyloalanina jest składnikiem większości białek roślinnych i zwierzęcych, uczestniczy w biosyntezie adrenaliny, melaniny, tyroksyny. Emisja fenyloalaniny jest obserwowana jedynie wtedy, gdy próbka proteinowa nie zawiera tyrozyny i tryptofanu, co jednak rzadko się zdarza.
Często fluoryzują również kofaktory (koenzymy), czyli niebiałkowe części enzymów. Przykładem może być NADH (dwunukleotyd adeninowy), pełniący ważną rolę w cyklu Krebsa i łańcuchu oddechowym – kompleksowych sposobach utleniania glukozy [7]. Fluoryzująca grupa NADH jest zredukowanym pierścieniem nikotynoamidowym. W roztworze jego fluorescencja jest częściowo wygaszana przez zderzenia lub przez bezpośredni kontakt z adeniną. Wiązanie się NADH z proteinami powoduje, że wydajność kwantowa NADH rośnie prawie czterokrotnie, także czas życia wzrasta od 0,4 ns do około 1,2 ns. Jednakże, w zależności od rodzaju proteiny, wydajność fluorescencji NADH może rosnąć lub maleć (wskutek wiązania się z proteiną). Wzrost wydajności kwantowej może następować wskutek wiązania się NADH w formie wydłużonej, co zapobiega bezpośredniemu kontaktowi pomiędzy adeniną a zredukowaną fluorescencyjną grupą nikotynoamidową.
Ryboflawina (witamina B2) w organizmie człowieka wchodzi w skład mononukleotydu flawinowego (FMN) i dinukleotydu flawino-adeninowego (FAD) – koenzymów, które są częściami enzymów biorących udział w przemianie glukozy i aminokwasów w procesach utleniania komórkowego. Odgrywa również ważną rolę w biochemicznych przemianach w siatkówce oka. FMN i FAD absorbują światło w zakresie widzialnym (około 450 nm) i emitują powyżej 525 nm. Typowe czasy życia FMN i FAD są równe 4,7 ns i 2,3 ns. Tak jak w przypadku NADH, fluorescencja flawiny jest wygaszana przez adeninę. To wygaszanie (statyczne) spowodowane jest tworzeniem się kompleksu flawiny z adeniną. W przeciwieństwie do NADH, który silnie fluoryzuje po związaniu się z proteiną, flawoproteiny nie fluoryzują, z pewnymi wyjątkami. Zanik natężenia fluorescencji wiązań proteinowo-flawinowych jest zazwyczaj złożony, dwuwykładniczy. Czasy zaniku składowych mają wartości równe 0,1 ns i 5 ns.
Podany wyżej ogólny opis użytecznie jest zilustrować przykładem. Enzym 17β-HSD (17-hydroxysteroid dehydrogenase) katalizuje ostatni etap biosyntezy estradiolu z estrogenu. Proteiny składają się z dwóch identycznych podjednostek, każda z nich ma pojedynczą resztę tryptofanową. Powoduje to wiązanie NADH jako kofaktora.
Związek NADPH jest identyczny z NADH (rys. 2.2.b.) z wyjątkiem grupy fosforanowej w pozycji 2' w rybozie. Przy wzbudzaniu w zakresie 295 nm zarówno proteina (17-HSD) jak i NADPH są wzbudzane. Dodanie NADPH do protein powoduje 30% wygaszanie fluorescencji protein i wzmocnienie fluorescencji NADPH [1].
NADH FAD
Badanie widm emisji NADPH pokazało, że jego emisja jest bardziej intensywna w obecności protein. Nie było jednak zbyt jasne z tych danych, czy wydajność kwantowa NADPH wzrasta wskutek wiązania czy też bezpromienistego przenoszenie energii, i co powoduje wzrost emisji NADPH. Możliwe jest wzbudzenie samego NADPH bez proteiny, używając do tego celu wzbudzenia w obszarze 340 nm. Widma te pokazują, że emisja NADH jest około cztery razy silniejsza w obecności protein. Można to zrozumieć wykonując miareczkowanie protein z NADPH.
W nieobecności protein emisja wzrasta liniowo wraz ze wzrostem stężenia NADPH. W obecności protein zaś intensywność początkowo wzrasta szybko a potem tak, jak w nieobecności protein. Początkowy wzrost intensywności NADPH spowodowany jest powstawaniem wiązania między NADPH a 17β-HSD, skutkuje to poczwórnym wzrostem wydajności kwantowej NADPH. Gdy wiązanie NADPH z 17β-HSD zostaje wysycone, natężenie fluorescencji wzr...
sklejka