Walidacja metod badawczych.pdf

LABORATORIUM 5/2009 | ... W LABORATORIUM

Walidacja

metod badawczych

STRESZCZENIE Artykuł

przedstawia wymagania dotyczące

walidacji metod badawczych,

deﬁ nicje cech charakterystycznych

metod badawczych oraz sposoby

przedstawiania dowodów na spełnienie

wymagań dotyczących konkretnego

zastosowania metody badawczej.

SŁOWA KLUCZOWE walidacja,

granica oznaczalności, granica

wykrywalności, liniowość, niepewność,

obciążenie, odchylenie standardowe,

odtwarzalność, powtarzalność, precyzja,

specyﬁ czność, selektywność

poprzez przedstawienie obiek-

tywnego dowodu, że zostały

spełnione wymagania dotyczące kon-

kretnego zamierzonego użycia lub za-

stosowania.

Przez dowód obiektywny należy

rozumieć dane potwierdzające istnie-

nie lub prawdziwość czegoś, a uzyskać

go można poprzez obserwację, pomiar

lub badanie. Czym jest wymaganie?

Norma PN-EN ISO 9000:2006 określa

w ten sposób potrzebę lub oczekiwanie,

które zostało ustalone, jest obowiązko-

we lub wynika z praktyki organizacji, jej

klientów lub innych stron zainteresowa-

nych. Określenie „zwalidowany” oznacza

związany z walidacją status, a walidację

można przeprowadzić w warunkach

rzeczywistych lub symulowanych. Jakie

wymagania nakłada norma PN-EN ISO/

IEC 17025:2005 Ogólne wymagania doty-

czące kompetencji laboratoriów badawczych

i wzorcujących ?

Laboratorium powinno przeprowadzić

walidację metod nieznormalizowanych,

metod znormalizowanych wykorzysty-

wanych poza przewidzianym dla nich

zakresem oraz metod znormalizowanych,

które zostały poszerzone lub zmodyfiko-

wane. Jednakże z praktyki laboratoryjnej

wynika, iż laboratoria poddają walidacji

również metody znormalizowane, stoso-

wane w przewidzianym przez nie zakre-

sie. Walidacja powinna być wykonana

w takim zakresie, jaki jest konieczny

dla zamierzonego stosowania. Dzięki

danym uzyskanym z walidacji labora-

torium może ustalić rzeczywisty zakres

(granice oznaczalności i wykrywalności),

oszacować niepewność oraz nadać ramy

dla wewnętrznej kontroli jakości badań.

W celu prawidłowego przeprowadzenia

walidacji należy wyróżnić trzy etapy:

1. Specyfikacja wymagań i określenie cech

charakterystycznych metod. Ustalamy,

jakie parametry chcemy zwalidować,

w jakim zakresie powinny się znaleźć,

ustalamy punkt odniesienia. Mogą być

to dane z dokumentu znormalizowa-

nego, inne źródło naukowe lub własne

doświadczenie laboratorium. Analitycy

stosujący np. spektrofotometryczne

metody badawcze i walidujący kolej-

ną taką metodę wiedzą, jakiego rzędu

powtarzalności czy niepewności mogą

się spodziewać.

2. Sprawdzenie, czy powyższe ściśle

określone wymagania mogą zostać

spełnione w przypadku zastosowania

danej metody.

3. Stwierdzenie przydatności metody oraz

dopuszczenie jej do stosowania.

Dodatkowe wymagania odnośnie do

walidacji metod mikrobiologicznych na-

kłada dokument EA-04/10 Akredytacja

laboratoriów mikrobiologicznych.

Walidacja powinna jak najlepiej od-

zwierciedlać warunki rzeczywiste dla me-

tody. Idealnie, gdy jest oparta o próbki

naturalne w całym zakresie badawczym.

Uzyskanie takich próbek środowiskowych

nie zawsze jest możliwe lub wymaga bar-

dzo długiego czasu, laboratoria stosują

więc próbki kontaminowane za pomocą

certyfikowanych wzorców fizykochemicz-

nych lub mikrobiologicznych kultur

odniesienia. Jednakże analityk zawsze

powinien mieć świadomość, że dodatek

do matrycy jest jedynie imitacją obecno-

ści naturalnie występujących substancji.

Zgodnie z PN-EN ISO/IEC 17025:2005

oraz dokumentem EA-04/10 proces wa-

lidacji wymaga sprawdzenia cech charak-

terystycznych dla metody analitycznej,

podanych w tabeli 1.

SUMMARY The article presents

requirements concerning validation

of research methods, deﬁ nitions of

characteristic features of research methods,

as well as ways of presenting evidence

of fulﬁ lling the requirements concerning

a speciﬁ c use of a research method.

KEY WORDS validation, limit

of quantiﬁ cation, limit of detection,

linearity, uncertainty, bias, standard

deviation, reproducibility, repeatability,

precision, speciﬁ ty, selectivity

mgr inż. Agnieszka Salata

ODDZIAŁ LABORATORYJNY

POWIATOWA STACJA SANITARNO EPIDEMIOLOGICZNA W ZGORZELCU

NIEPEWNOŚĆ

WYNIKU POMIARU

Niepewność to parametr związany z wy-

nikiem pomiaru charakteryzujący rozrzut

wartości, które można w uzasadniony

W alidacja jest potwierdzeniem

... W LABORATORIUM | LABORATORIUM 5/2009

WYMAGANIA DOKUMENTU EA 4/10

WYMAGANIA PN EN ISO/IEC 17025:2005

METODY JAKOŚCIOWE

METODY ILOŚCIOWE

Specyficzność

Niepewność wyniku

Względna poprawność

Czułość

Liniowość

Odchylenie dodatnie i ujemne

Względna poprawność

Odporność na czynniki zewnętrzne

Granica wykrywalności

Odchylenie dodatnie i ujemne

Granica powtarzalności

i/lub odtwarzalności

Efekt matrycowy Powtarzalność

Powtarzalność i odtwarzalność Odtwarzalność

Granica oznaczalności

Tabela 1. Wymagania dokumentu EA-4/10 oraz PN-EN ISO/IEC 17025:2005 dla procesu walidacji

sposób przypisać wielkości mierzonej

(PN-ISO 10012:1998).

Metody szacowania niepewności po-

miaru podano w artykule (12).

konać pomiaru spektrofotometrycznego

w różnym czasie trwania reakcji barwnej.

Istotne jest, by w jednym czasie badać

zmianę tylko jednej wartości.

kami badania otrzymanymi w ustalonych

warunkach. Za miarę precyzji przyjmu-

je się zwykle odchylenie standardowe

wyników badania lub współczynnik

zmienności. Im większe jest odchylenie

standardowe, tym mniejsza jest precyzja.

Aby oszacować odchylenie standardowe,

należy dokonać minimum 15 serii pomia-

rów, w których czynnikiem zmienności

będzie czas, np. w ciągu 10 dni. Należy

zastosować wzór:

LINIOWOŚĆ

Liniowość jest zakresem metody badaw-

czej, w którym sygnał wyjściowy jest

proporcjonalny do oznaczanego stęże-

nia substancji. Możemy mieć pewność,

że metoda badawcza jest liniowa i zawiera

cały badany zakres stężeń, gdy współ-

czynnik nachylenia jej krzywej wzorcowej

jest większy bądź równy 0,999. Możemy

go obliczyć ze wzoru na funkcję liniową

y = bx + a, gdzie y to sygnał pomiarowy

(np. absorbancja), x – stężenie analitu,

a – współczynnik przesunięcia, natomiast

b to poszukiwany przez nas współczynnik

nachylenia prostej, zwany też współczyn-

nikiem kierunkowym.

WARUNKI

POWTARZALNOŚCI

I ODTWARZALNOŚCI

Warunki powtarzalności to takie warun-

ki, w których niezależne wyniki badania

takich samych obiektów są otrzymane

za pomocą tej samej metody, w tym sa-

mym laboratorium, przez tego samego

analityka, z użyciem tego samego wy-

posażenia, w krótkich odstępach czasu.

Warunki odtwarzalności dotyczą róż-

nych laboratoriów, różnych operatorów

oraz różnego wyposażenia. Warunki

powtarzalności pośredniej, najczęściej

spotykane w praktyce laboratoryjnej,

to takie warunki, w których niezależne

wyniki badania takich samych obiek-

tów są otrzymane za pomocą tej samej

metody, w tym samym laboratorium,

z użyciem tego samego wyposażenia,

przez różnych operatorów, w dłuższych

odstępach czasu.

i x

gdzie n jest liczbą serii pomiarów, x i to i-ty

wynik, natomiast x to wartość średnia

wyników.

Dla metod mikrobiologicznych pre-

cyzję możemy wyrazić poprzez względne

odchylenie standardowe:

RSD

ODPORNOŚĆ

NA CZYNNIKI ZEWNĘTRZNE

By udowodnić, że metoda badawcza speł-

nia wszystkie wymagania odnośnie do wła-

ściwego jej stosowania, należy wyodrębnić

te jej etapy, których zmiana może mieć

wpływ na wynik badania. Mogą to być

warunki panujące w cieplarce, wahające

się np. w zakresie 37 ± 1°C, gdy tymcza-

sem metoda badawcza wymaga hodowli

w temperaturze 37 ± 0,5°C. Może to być

również czas, który jest potrzebny na zaj-

ście reakcji barwnej w analizie chemicznej.

W pierwszym przypadku, jeżeli nie mamy

możliwości ustawienia stabilności tempe-

ratury w cieplarce na 37 ± 0,5°C, należy

udowodnić, że temperatury 36°C oraz

38°C nie mają wpływu na liczbę wy-

rosłych kolonii. Dokonać tego można

poprzez procentowe porównanie liczby

kolonii wyrosłych na podłożu dla każdej

z tych temperatur z liczbą kolonii dla

temperatury 37°C. W przypadku poda-

nej reakcji fizykochemicznej można do-

g dzi e S jest odchyleniem standardowym,

a x – średnią liczbą jednostek tworzą-

cych kolonie. RSD wyrażone w procen-

tach jest współczynnikiem wariancji

(zmienności).

ODCHYLENIE

STANDARDOWE

POWTARZALNOŚCI

I ODTWARZALNOŚCI

Odchylenie standardowe wyników badania

otrzymanych w spełnionych warunkach

powtarzalności jest miarą rozrzutu roz-

kładu wyników badania. Podobnie mogą

być określone wariancja powtarzalności

i współczynnik zmienności powtarzal-

ności, które również mogą być używane

jako miary rozrzutu wyników badania.

Odchylenie standardowe odtwarzalności

jest natomiast miarą rozrzutu wyników

w warunkach odtwarzalności. Powtarzal-

ność i odtwarzalność wyrażają precyzję

metody badawczej, która jest stopniem

zgodności pomiędzy niezależnymi wyni-

% RSD

•

100

GRANICA POWTARZALNOŚCI

I ODTWARZALNOŚCI

Granica powtarzalności to wartość, któ-

rej z prawdopodobieństwem 95% nie

przekracza wartość bezwzględna różnicy

między dwoma wynikami badania otrzy-

manymi w spełnionych warunkach powta-

rzalności. Granicę powtarzalności oznacza

się zwykle przez r . Granica odtwarzalności

wymaga spełnienia warunków odtwarzal-

ności, a oznacza się ją literą R .

W praktyce laboratoryjnej wymaga

się sprawdzenia zaobserwowanej różnicy

pomiędzy dwoma (lub więcej) wynikami

badania, i dlatego bardziej potrzebna

LABORATORIUM 5/2009 | ... W LABORATORIUM

jest pewna wartość krytyczna tej różnicy

niż odchylenie standardowe. Odchylenie

standardowe takiej różnicy to:

Druga sytuacja zachodzi, gdy w labo-

ratorium w warunkach powtarzalności

otrzymano n wyników badania, z któ-

ryc h uzyskano średnią arytmetyczną

y . Natomiast nieznany jest składnik

obciążenia pochodzący z laboratorium

i należy dokonać porównania z wartością

odniesienia μ 0 poprzez zastosow an ie od-

chylenia standardowego różnicy | y - μ 0 |.

Różnica krytyczna wynosi teraz:

obecność jednostki tworzącej kolonię

(jtk), lub najmniejsza liczba jtk możliwa

do wykrycia w danej objętości matrycy.

OBCIĄŻENIE,

BŁĄD SYSTEMATYCZNY,

POPRAWNOŚĆ

Obciążenie jest różnicą między wartością

oczekiwaną wyników badania a przyjętą

wartością odniesienia. Jest to błąd syste-

matyczny, w odróżnieniu od błędu loso-

wego. W oparciu o materiał odniesienia

możemy dokonać oszacowania błędu

systematycznego. Analiza materiału od-

niesienia i porównanie uzyskanej śred-

niej z wartością deklarowaną przez np.

producenta certyfikowanego materiału

pomoże odpowiedzieć na pytanie, jakie

jest obciążenie metody (bias) wewnątrz

laboratorium. Bias można oszacować

również poprzez analizę wyników badań

międzylaboratoryjnych, jednak powinny

być to badania odnoszące się do warto-

ści zadanej przez organizatora badań,

a nie odnoszące się do średniej uzyska-

nej przez wszystkie laboratoria biorące

udział w porównaniach.

gdzie n = 2 dla dwóch wyników badania.

W praktyce statystycznej stosuje się

różnicę krytyczną:

(

)

(

)

gdzie f to współczynnik rozstępu kry-

tycznego.

Zakładając rozkład normalny i poziom

prawdopodobieństwa 95%, wartość f wy-

nosi 1,96, czyli 2

f = 2,8. Można zatem

zależność tę przedstawić jako 2,8 • s . Dzię-

ki tym przekształceniom otrzymujemy

wzory opisujące granicę powtarzalności

i odtwarzalności:

ZAKRES ROBOCZY

Zakres roboczy to przedział, w którym

można stosować metodę badawczą z ak-

ceptowalną precyzją, dokładnością oraz

liniowością. Dla metod fizykochemicz-

nych dolna granica zakresu może odpo-

wiadać granicy oznaczalności. Czym jest

granica oznaczalności ( limit of quantifi-

cation )? Jest to najmniejsze stężenie lub

najmniejsza liczba mikroorganizmów

możliwa do ilościowego oznaczenia

daną metodą z określoną precyzją oraz

dokładnością. Z granicą oznaczalności

związana jest granica wykrywalności ( limit

of detection ). Jest to najmniejsze stężenie

lub najmniejsza liczba mikroorganizmów

możliwa do wykrycia za pomocą danej

metody badawczej. Granica wykrywalno-

ści może być wyznaczona na podstawie

odchylenia standardowego z 10 pomia-

rów próbki ślepej. Jeśli próbka ślepa nie

zawiera poszukiwanego czynnika, można

dodać do próbki minimalną wykrywalną

ilość wzorca. Wzbogacamy próbę ślepą

o określone minimalne stężenie wzorca

(może to być stężenie znajdujące się w po-

łowie między 0 a punktem 1 na krzywej

wzorcowej). Trzykrotne odchylenie stan-

dardowe będzie interesującą nas granicą

wykrywalności ( LOD ), która pomoże nam

wyznaczyć granicę oznaczalności ( LOQ )

za pomocą zależności:

R = 2,8 S r oraz R = 2,8 S R

Ustaliliśmy już odchylenie standardowe

na podstawie minimum 15 serii pomia-

rowych. Jeżeli w dalszej praktyce chcemy

ocenić dwa pojedyncze wyniki badania,

otrzymane w warunkach powtarzalności

lub odtwarzalności, dokonujemy ich po-

równania z powyższymi granicami.

Zaleca się, aby wartość bezwzględna

różnicy pomiędzy dwoma wynikami nie

przekraczała granicy powtarzalności. Jeżeli

to wymaganie jest spełnione, oba wyniki

uznaje się jako akceptowalne, a ich śred-

nia arytmetyczna może być podana jako

wynik końcowy. Innego sposobu działania

wymaga sytuacja, gdy należy wyliczyć gra-

nice w oparciu o więcej niż dwie wartości.

Możemy mieć do czynienia z dwoma przy-

padkami. Pierwszy przypadek ma miejsce,

gdy w laboratorium w warunkach powta-

rzalności przeprowadzono dwie grupy

pomiarów i w pierwszej z nich otrzym ano

n 1 wyników o średniej arytmetycznej y ,

a w dr ugiej grupie – n 2 wyników o śred-

niej y . Wt e dy odchylenie standardowe

różnicy ( y - y ) wynosi:

CZUŁOŚĆ, SELEKTYWNOŚĆ,

SPECYFICZNOŚĆ

Czułość określa, jaką najmniejszą różni-

cę, odpowiedź czynnika na metodę ba-

dawczą jesteśmy w stanie stwierdzić. Np.

w przypadku spektrofotometrycznych me-

tod fizykochemicznych zależność ta jest

liniowa, a jej miarą jest współczynnik

nachylenia krzywej wzorcowej, i z niego

możemy obliczyć czułość metody.

Selektywność/specyficzność daje nam

odpowiedź, jak dokładnie nasza metoda

badawcza jest w stanie wytypować poszuki-

waną przez nas cechę w złożonej matrycy

oddziałującej w różny sposób na obiekt

poszukiwań. Norma ISO/TR 13843:2000

proponuje dla metod mikrobiologicznych

określenie czułości, specyficzności oraz

selektywności poprzez wykonanie analizy

płytki z pojedynczymi koloniami. Nale-

ży dokonać potwierdzeń właściwych dla

metody badawczej i policzyć, ile kolonii

prawidłowo uznano za poszukiwane (a),

ile kolonii uznanych za nietypowe okazało

się poszukiwanymi (b), ile kolonii uznano

za poszukiwane, a nimi nie było (c), oraz

ile kolonii nietypowych okazało się po-

szukiwanymi przez nas. Wtedy za czułość

metody możemy przyjąć iloraz a/(a+b),

specyficzność to d/(c+d), natomiast se-

lektywność to log[(a+c)/n].

LOQ = 3* LOD

•

W przypadku analiz chromatograficznych

możliwe jest wyznaczenie granicy wykry-

walności i oznaczalności na podstawie

szumów urządzenia pomiarowego. Dla

metod fizykochemicznych granica ozna-

czalności może być pierwszym punktem

na krzywej wzorcowej. W przypadku me-

tod mikrobiologicznych granicą wykry-

walności będzie najmniejsze rozcieńcze-

nie, w jakim jesteśmy w stanie stwierdzić

zaś różnica krytyczna dla | y - y |

wynosi:

1 2

... W LABORATORIUM | LABORATORIUM 5/2009

wymagania nałożone

w procesie walidacji powodują

złożoną wewnętrzną kontrolę

jakości badań, a co za tym

idzie – problemy w utrzymaniu

założonego poziomu jakości.

ODZYSK

Odzysk informuje nas, jaki wpływ na wy-

nik badania mają metoda badawcza oraz

badana matryca – czy powodują straty

obiektu analizowanego. Do próbki badanej

możemy dodać fizykochemiczne certyfi-

kowane wzorce odniesienia lub ilościowe

mikrobiologiczne kultury odniesienia i na-

stępnie dokonać analizy zgodnie z meto-

dą badawczą. Dzięki znajomości stężenia

wzorca lub ilości bakterii wyjściowych oraz

wyniku naszej analizy możemy obliczyć

odzysk za pomocą prostej zależności:

a co za tym idzie – problemy w utrzymaniu

założonego poziomu jakości, które pro-

wadzą do częstych kalibracji, sprawdzeń,

a wreszcie rewalidacji metody badawczej.

Może tak się zdarzyć, gdy walidacja jest

oparta o próby kontaminowane, a nie

rzeczywiste. Wtedy rutynowa analiza

próbek rzeczywistych weryfikuje warto-

ści ustalone w czasie walidacji. Jednakże

doskonała znajomość metody badawczej

oraz jej wymagań i ograniczeń sprawia,

iż nadzorowane są wszystkie czynniki

mające wpływ na jakość wykonywanych

badań i ostatecznie na wynik badania. 

4. PN-ISO 5725-2:2002 Dokładność (po-

prawność i precyzja) metod pomiarowych

i wyników pomiarów – Część 4: Podstawowe

metody wyznaczania poprawności standardowej

metody pomiarowej .

5. PN-ISO 5725-2:2002 Dokładność (po-

prawność i precyzja) metod pomiarowych

i wyników pomiarów – Część 5: Alternatyw-

ne metody wyznaczania precyzji standardowej

metody pomiarowej .

6. PN-ISO 5725-2:2002 Dokładność (po-

prawność i precyzja) metod pomiarowych

i wyników pomiarów – Część 6: Stoso-

wanie w praktyce wartości określających

dokładność .

7. Ocena i kontrola jakości wyników pomiarów

analitycznych . Praca zbiorowa, WNT, War-

szawa 2007.

8. Dobecki M.: Zapewnienie jakości analiz

chemicznych . IMP, Łódź 2004.

9. PN-EN ISO/IEC 17025:2005/Ap1:2007

Ogólne wymagania dotyczące kompeten-

cji laboratoriów badawczych i wzorcu-

jących .

10. PN-EN ISO 9000:2006 Systemy zarządza-

nia jakością – Podstawy i terminologia .

11. EA-04/10 Akredytacja laboratoriów mikro-

biologicznych .

12. Salata A.: Szacowanie niepewności pomia-

ru w badaniach fizykochemicznych i mikro-

biologicznych. „Laboratorium – Przegląd

Ogólnopolski”, 2009, 3, 28-32.

odzysk = (X k – X 0 )/X w

Piśmiennictwo

1. PN-ISO 5725-1:2002 Dokładność (po-

prawność i precyzja) metod pomiarowych

i wyników pomiarów – Część 1: Ogólne za-

sady i definicje .

2. PN-ISO 5725-2:2002 Dokładność (po-

prawność i precyzja) metod pomiarowych

i wyników pomiarów – Część 2: Podsta-

wowa metoda określania powtarzalności

i odtwarzalności standardowej metody

pomiarowej .

3. PN-ISO 5725-2:2002 Dokładność (po-

prawność i precyzja) metod pomiarowych

i wyników pomiarów – Część 3: Pośrednie

miary precyzji standardowej metody pomia-

rowej .

gdzie: X k to stężenie w próbce kontamino-

wanej, X 0 – stężenie w próbce przed konta-

minacją, natomiast X w to stężenie wzorca.

Odzysk należy wyrazić procentowo.

PODSUMOWANIE

Analityk musi mieć świadomość, jakie pa-

rametry są niezbędne w procesie walidacji

metody analitycznej. Każdy dodatkowy

parametr wymaga czasu i generuje ramy

dla wewnętrznej kontroli jakości badań.

Zbyt restrykcyjne wymagania nałożone

w procesie walidacji powodują złożo-

ną wewnętrzną kontrolę jakości badań,

Z byt restrykcyjne

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: