Cwiczenie 3.doc

(49 KB) Pobierz
Ćwiczenie 3 –genetyka

Ćwiczenie 3

 

Enzymy restrykcyjne-są to endonukleazy tnące DNA w specyficznych miejscach, niezależnie od  jego pochodzenia. Stały się one 1-szym narzędziem stosowanym do pocięcia całego genomu  na charakterystyczne  fragmenty DNA (tzw. Fragmenty restrykcyjne).W ten sposób  geny lub zespoły genow stają się  jednostkami fizycznie możliwymi do wyizolowania , a nie tylko informacja rozsianą w olbrzymiej ciągłości genomu. W warunkach naturalnych  enzymy te występują w komórkach bakterii i sinic i pełnia tam rolę systemu obronnego. Ich zadaniem jest niszczenie obcego DNA najcześciej wirusowgo. Własny  DNA nie jest niszczony gdyż nie ma w nim  specyficznych rozpoznawanych przez restryktazy sekwencji zasad albo Są one zmetylowane i w ten sposób staja się niedostępne dla enzymu. Obecnie znanych jest ok. 3000 enzymów restrykcyjnych natomiast niewiele z nich ma zastosowanie .Zasady nazewnictwa np. Eco R I - 1- sza litera – rodzaj bakterii, z której wyizolowano enzym, 2 następne litery-gatunek bakterii, z której wyizolowano enzym, R –szczep, cyfra  rzymska-przedstawia klejnosc odkrycia enzymu u tego samego gatunku bakterii. Charakterystyczna cechą  enzymów restrykcyjnych jest rozpoznawanie swoistych dla danego enzymu sekwencji zasad w Dna (4-8 pz).Charakterystyczna cechą rozpoznawanych sekwencji  jest polindromiczność-co oznacza, że kolejność zasad w jednej nici Dna  odczytywana w kierunku 5` à3`  jest taka sama jak kolejność  zasad w drugiej nici w kierunku 5`à3`.Endonukleazy  rozpoznawszy sekwencje tną Dna albo w obrębie tej sekwencji albo w pewnej odległości od niej. Ze względu na miejsce cięcia,  ale tez ze względu na kofaktory i ilość podjednostek można dokonać podziału enzymów restrykcyjnych na 3 klasy.

Klasa I- najliczniejsza i najbardziej skomplikowana,3 podjednostki, aktywność metylazy. Działanie zależy od kofaktorów ATP, jony magnezu i s-adenozynometionina.  Enzymy rozpoznają sekwencję łączą się z nią, ale tną w pewnej odległości –nawet 1000 pz od miejsca rozpoznawanego.

Klasa III-2 typy podjednostek. Wymagają ATP, jonów magnezu ,s-adenozynometionia nie jest niezbędna. Przecinają Dna w pewnej odległości od rozpoznanej sekwencji- ok. 25 nukleotydów.

Klasa II-najprostszy system , 1 typ podjednostki . Aktywowane jonami magnezu,nie maja aktywności metylazy. Przecinają Dna w miejscu  rozpoznawanej sekwencji.

Do badań genetycznych wykorzystywana jest tylko klasa II.

Typy cięć-enzymy restrykcyjne mogą  przecinać podwójną nić Dna na 2 różne sposoby:

-przecinają obie nici Dna  na tej samej wysokości(naprzeciw siebie) tak że powstają  zakończenia Dna z tępymi końcami, na których nie ma wolnych niesmarowanych zasad. fragmenty o tępych końcach mogą się połączyć tylko za pomocą enzymu ligazy polinukleotydowej T4.

-przecinają  każdą nić Dna nie naprzeciwko siebie, ale cięcia na 2 niciach przesunięte są jedno względem drugiego o kilka zasad. Powstają w ten sposób lepkie końce, na których znajdują się niesmarowane  zasady. Końce te mogą  tworzyć wiązania wodorowe  zgodnie z zasadą komplementarności z lepkimi końcami każdego innego fragmentu Dna powstałego powstałego wyniku działania tej samej endonukleazy.

Zastosowanie-inżynieria genetyczna  umożliwiły postęp w mapowaniu genomu,nieodzowne w analizie RFLP, wykrywanie mutacji, ustalanie stopnia pokrewieństwa , ustalanie ojcostwa, kryminalistyka.

 

RFLP- polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. Jest to polimorfizm  fragmentów Dna powstających  wyniku działania  enzymów restrykcyjnych na nic Dna. Polimorfizm ten może być wynikiem  tranzycji, transwersji , delecji, inercji co prowadzi do powstania lub zaniku miejsca rozpoznawanego przez  enzymy restrykcyjne. Mutacje  zachodzące w obrębie miejsc restrykcyjnych zmieniają  długość fragmentów restrykcyjnych, które można wykrc np. metodą Southerna. Polimorfizm fragmentów restrykcyjnych  jest dość powszechny , szczególnie w  niekodujących regionach Dna.

Zastosowanie-identyfikacja mutacji  w chorobach  genetycznych –tą metoda badamy mutacje znane. Badanie dziedzicznych uwarunkowań do powstania  danych chorób genetycznych. Mapowanie genów.

SSCP- metoda ta wykorzystuje unikalną właściwość kwasów nukleinowych  polegającą na tworzeniu przez pojedyncze nici Dna tzw. konformerów, których kształt jest zależny od sekwencji Dna np. mutacje punktowe zmieniają konformacje pojedynczej nici Dna co jest wykrywane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym

Przebieg procesu- amplifikacja badanego fragmentu Dna met PCR ze znakowaniem fosforemàprodukt PCR wyznakowały radioizotopemàdenaturacjaàjednoniciowe fragmenty Dna  wykazujące polimorfizm tzw. konformeryàelektroforeza w niedenaturującym żelu poliakrylamidowaym i autoradiografia

Zastosowanie-metoda wykorzystana do badań mutacji nieznanych

 

 

Hybrydyzacja z sondą molekularną

Hybrydyzacja to zdolność 2 komplementarnych lub częściowo komplementarnych  cząsteczek kwasów nukleinowych do tworzenia stabilnej hybrydy o zasadach połączonych w pary . Wzajemne  oddziaływanie  między cząsteczka badanego kwasu nukleinowego a cząsteczką sondy prowadzi do utworzenia hybrydy(dupleksu). Hybrydyzacja może zachodzić między 2 dowolnymi jednoniciowymi łańcuchami kwasów nukleinowych:DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA. Łączenie się z sonda jest wysoce specyficzne i zachodzi wg. zasady komplementarności. Podstawową cechą hybrydyzacji jest specyficzność i stabilność formowanego hybrydu. Stabilność  powstającego kompleksu jest tym większa im dłuższe odcinki  wykazują komplementarność nukleotydów.

Sondą molekularną mogą być:

-syntetyczne odcinki DNA służące do wykrywania pojedynczych substytucji nukleotydowych

-naturalne geny zawierające oprócz sekwencji kodujących także sekwencje flankujące  i wtrącone wchodzące w skład danego genu

-syntetyczne geny zawierające wyłącznie sekwencje kodujące

-odcinki c DNA syntetyzowane przy pomocy odwrotnej transkryptazy

-fragmenty chromosomów  stosowane, gdy molekularne podłoże choroby nie jest znane znany jest natomiast region chromosomu, w którym lub w pobliżu, którego występuje mutacja

-sondy genomowe

-odcinki DNA  komplementarne do r RNA stosowane w diagnostyce radiologicznej

Aby wykryć taką sondę musi być ona znakowana: znakowanie radioaktywne(stosowane  fosfor , wodór, siarka), lub metody fluorescencyjne- bardziej proste i mniej niebezpieczne.

Hybrydyzacja metodą Southern

Zadaniem   tego typu hybrydyzacji jest identyfikacja  poszukiwanych sekwencji DNA w mieszaninie  fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.

Etapy:

1) Genomowy DNA trawiony przez  wybrane enzymy restrykcyjne

2) Fragmenty DNA otrzymane  po trawieniu  rozdziela się przez elektroforezę w żelu agarozowym

3) Zestaw fragmentów restrykcyjnych przenosi się z żelu agarozowego  na błonę nylonową( filtr nitrocelulozy)

4) Badany fragment wykrywa się przez hybrydyzacje z sondą

Metoda Southerna stosowana jest powszechnie do badań polimorfizmu DNA.

Zastosowanie-analiza RFLP

 

Metoda Nothern

W przeciwieństwie do met Southern tym co rozdzielamy jest RNA natomiast sondą możę być DNA. Wszystkie etapy procesu są takie same. Najtrudniejsza w tej metodzie jest sama izolacja RNA  gdyż jest ono niestabilne i łatwo ulega  trawieniu przez endonukleazy.

Metoda Western

Hybrydyzacja dotyczy białek. Na membranę przenosimy białka a detekcji  dokonujemy przeciwciałami znakowanymi(hybrydyzacja z białkami unieruchomionymi  na membranie)

 

Hybrydyzacja in situ

Jest to technika cytochemiczna służąca do  wykrywania pojedynczego genu  lub jego fragmentu  bezpośrednio w preparacie cytogenetycznym i cytologicznym(tkankowym)

In situ oznacza :w miejscu  naturalnego występowania. Metodą tą można badać swoistą ekspresję  genu w komórce lub tkance.

Materiał: skrawki tkanek, pojedyncze komórki, struktury subkomórkowe tj. chromosomy

Prowadzona jest bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym bez przenoszenia na nośnik;w zawiesinach komórek  lub próbkach tkanek pobranych w czasie biopsji. Aby zastosować hybrydyzacje In situ DNA w chromosomie  musi być w formie 1-niciowej. Podstawowe warunki hybrydyzacji In situ to czułość i rozdzielczość.

 

 

 

Fluorescencyjna hybrydyzacja In situ-FISH

Technika ta wykorzystuje fluorescencyjne metody detekcji sondy . Po hybrydyzacji preparat ocenia się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Ze względu na duża rozdzielczość rozdzielczość łatwość użycia FISH wyparł radioaktywną  hybrydyzacje in situ.

Wykorzystuje się 3 rodzaje sond:

-centromerowe

-malujące

-unikatowe

Etapy:

-przygotowanie preparatu chromosomowego

-denaturacja DNA chromosomowegoàpowstają 1-niciowe łańcuchy

- jednocześnie przygotowujemy sondę (denaturacja z wytworzeniem fragmentow jednoniciowych , znakowanie)

-hybrydyzacja In situ –nakrapiamy sondę na preparat chromosomowy

-odstawienie i tworzenie się hybryd

-po hybrydyzacji odpukanie niespecyficznie związanej sondy

-detekcja związanej sondy(metoda bezpośrednia-od razu preparat oglądany pod mikroskopem fluorescencyjnym albo jeśli znacznikiem była biotyna dodać avidynę i fluoresceinę-metoda pośrednia)

Zastosowanie

-wykrywanie aberracji chromosomowych-liczbowych i strukturalnych

-wykrywanie mikrodelecji

-identyfikacja złożonych translokacji

-diagnostyka komórek nowotworowych

-diagnostyka prenatalna

-wykrywanie płci

-identyfikacja chromosomów markerowych

 

Sekwencjonowanie DNA

1.       Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gillberta)

2.       Metoda terminacji łańcucha – metoda Sangera, metoda dideoksy

 

1 - Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gillberta)

·         Izolacja DNA

·         Denaturacja – 1 nić

·         Znakowanie (np. izotopami radioaktywnymi) na końcu 5’

·         W wyniku różnych reakcji chemicznych dochodzi do metyzacji odpowiednich zasad DNA

o        dodanie siarczku dimetylu powoduje metyzację guaniny

o        Kwas mrówkowy – adenina lub guanina

o        Hydrazyna – tymina i cytozyna

o        Hydrazyna i stężona sól - cytozyna

·         Dodajemy piperydyny – usuwa zmetylowane zasady i przerywa łańcuch DNA

·         W efekcie otrzymujemy różnej długości łańcuchy pociętego DNA

·         Które następnie poddajemy elektroforezie na żelu poliakrylamidowym

 

2. - Metoda terminacji łańcucha – metoda Sangera, metoda dideoksy

·         Starter, polimeraza DNA, deoksyrybonukleotydy

·         W każdej próbówce znajduje się też pewna ilość dideoksyrybonukleotydów (w każdej po 1 specyficznym)

·         Polimeraza DNA nie ma zdolności rozróżnienia czy wbudowywany nukleotyd to dideoksy, czy prawidłowy

·         Po wbudowaniu w łańcuch dideoksyrybonukloeotydu następuje koniec elongacji łańcucha

·         Ponieważ w każdej probówce znajduje się określony dideoksyrybonukleotyd, wiemy jaka zasada została wbudowana ostatnia

·         W wyniku elektroforezy możemy odczytać sekwencję DNA

 

Mikromacierze DNA

·         Pozwalają na badanie całej grupy genów

·         Hybrydyzacja jednoczasowa w kilku grupach genów

·         Opiera się na metodzie Southern lub Northern

 

Zgłoś jeśli naruszono regulamin