rozmnażanie wegetatywne, szczepienie,somatyczna embriogeneza.pdf
(
358 KB
)
Pobierz
71_92 szczygiel.vp:CorelVentura 7.0
L
EŒNE
P
RACE
B
ADAWCZE
, 2005, 3: 71–92.
Krystyna S
ZCZYGIE£
*
SOMATYCZNA EMBRIOGENEZA – ALTERNATYWNY
SPOSÓB UZYSKANIA WYSELEKCJONOWANEGO
MATERIA£U SADZENIOWEGO GATUNKÓW DRZEW
IGLASTYCH
SOMATIC EMBRYOGENESIS – AN ALTERNATIVE WAY TO PRODUCE
IMPROVED PLANTING STOCK OF CONIFEROUS TREE SPECIES
Abstract
. Somatic embryogenesis in conifers as an effective vegetative propa-
gation method, offers a great multiplicative potential in a short time as well as
the possibility of cryopreservation the embryogenic tissue. Mass vegetative
propagation via tissue culture (micropropagation, clonal propagation) of se-
lected, improved material give many advantages over conventional methods
(cutting, grafting). Plants can be produced by tissue culture through one of two
different pathways: organogenesis or somatic embryogenesis. Organogenesis
is developmental process where organ primordia are initiated on a explant (for
ex. bud, leaf), after exogenously applied hormones. After organ initiation sev-
eral steps – shoot elonagation, rooting and acclimatization are required to ob-
tain plant. Somatic embryogenesis – is the process of formation and
development of somatic embryos from vegetative (somatic) tissue. This process
can be divided into different steps: 1) initiation of embryogenic tissue from the
primary explant (mature or immature zygotic embryo, cotyledon, needle), 2)
multiplication of embryogenic tissue, 3) maturation of somatic embryos, 4) ger-
mination of somatic embryos, 5) plant regeneration. A short historical aspects
of somatic embryogenesis in woody plants and its application for forest regen-
eration is presented. Vegetatively propagated material via somatic embryo-
genesis offers many advantages over seed material and can be used for forest
tree breeding and reforestation programmes.
Key words:
explant, organogenesis, somatic embryogenesis, somatic embryo,
embryogenic tissue (callus).
* Instytut Badawczy Leœnictwa, Zak³ad Genetyki i Fizjologii Drzew Leœnych, Sêkocin Las,
05-090 Raszyn, e-mail: szczygik@ibles.waw.pl
72
K. Szczygie³
1. WPROWADZENIE
Wegetatywne rozmna¿anie drzew, polegaj¹ce na uzyskiwaniu nowych osob-
ników drog¹ regeneracji z czêœci organizmu macierzystego, pozwala skuteczniej
ni¿ rozmna¿anie generatywne zachowaæ po¿¹dane cechy hodowlane u potomstwa.
W leœnictwie u³atwia ono szybkie wprowadzenie do praktyki wyników selekcji
drzew. Metody wegetatywnego rozmna¿ania znajduj¹ zastosowanie w leœnictwie
g³ównie ze wzglêdu na póŸne osi¹ganie przez drzewa wieku dojrza³oœci gene-
ratywnej, okresowoœæ kwitnienia i obradzania nasion oraz wystêpowanie
czynników powoduj¹cych pogorszenie stanu zdrowotnego lub wrêcz zamieranie
cennych populacji, a tak¿e w przypadku rozmna¿ania nowych form roœlin uzys-
kanych przez krzy¿owanie, a przede wszystkim w celu uzyskania wegetatywnego
potomstwa drzew doborowych i elitarnych do zak³adania plantacji nasiennych.
W szkó³karstwie leœnym wegetatywne rozmna¿anie drzew jest szeroko sto-
sowane. Tradycyjne metody mno¿enia drzew, jak ukorzenianie zrzezów pêdowych
(zdrewnia³ych i zielnych) i korzeniowych, szczepienia, odrosty czy odk³ady, maj¹
szereg ograniczeñ. Metody te czêsto wymagaj¹ specjalnych mateczników, które
musz¹ byæ odpowiednio pielêgnowane i odm³adzane, w celu zachowania przez
roœliny mateczne zdolnoœci do regeneracji. Efektywnoœæ tych metod (szczególnie
ukorzeniania zrzezów) zale¿y od wieku roœliny matecznej i jest wysoka niemal
wy³¹cznie w przypadku pozyskiwania zrzezów z m³odych roœlin matecznych. Przy
wegetatywnym rozmna¿aniu drzew iglastych spotykany jest czêsto u nowopo-
wsta³ych sadzonek wzrost plagiotropowy, czyli poziomy wzrost pêdów, bez wy-
raŸnego przewodnika. Natomiast przy szczepieniu utrudnieniem jest wyrastanie z
podk³adek pêdów konkuruj¹cych ze zrazami, co w wypadku plantacji nasiennych
jest ca³kowicie niedopuszczalne. Ponadto, stosuj¹c tradycyjne metody uzyskuje siê
ma³¹ wydajnoœæ rozmna¿ania z jednej roœliny matecznej.
Najnowszym sposobem masowego, klonalnego rozmna¿ania drzew jest ich we-
getatywne rozmna¿anie in vitro, metod¹ hodowli tkanek (tzw. mikrorozmna¿anie).
Podstawowe zalety i cele rozmna¿ania drzew leœnych metod¹ kultur tkan-
kowych to:
– mo¿liwoœæ uzyskania w krótkim czasie du¿ej liczby genetycznie iden-
tycznych osobników (rozmna¿anie klonalne) z ma³ej iloœci materia³u wyjœciowego
(eksplantaty pierwotne: dojrza³e i niedojrza³e zarodki zygotyczne, liœcienie, ig³y,
liœcie, p¹ki wierzcho³kowe i boczne),
– kriokonserwacja materia³u uzyskanego drog¹ in vitro: wykorzystanie ma-
teria³u otrzymanego drog¹ somatycznej embriogenezy (kalus embriogenny, so-
matyczne zarodki i sztuczne nasiona) oraz organogenezy (p¹ki, pêdy z p¹kami) do
d³ugoterminowego przechowywania w ciek³ym azocie w temperaturze -196 °C,
– mo¿liwoœæ otrzymania w krótkim okresie wartoœciowego wyselekcjono-
wanego materia³u sadzeniowego, ulepszonego genetycznie ze wzglêdu na war-
toœciowe cechy dla leœnictwa, ró¿nych ga³êzi przemys³u czy produkcjê metabo-
litów wtórnych dla potrzeb farmacji i przemys³u kosmetycznego,
Somatyczna embriogeneza – alternatywny sposób uzyskania wyselekcjonowanego materia³u...
73
– mo¿liwoœæ regeneracji gatunków drzew, które trudno rozmna¿aj¹ siê
tradycyjnymi metodami wegetatywnego mno¿enia (np. sosna, d¹b, buk),
– rozmna¿anie gatunków drzew, których nasiona s¹ trudne do przechowy-
wania przez d³ugi okres (tzw. „recalcitrant” – dêby, jawor, klon srebrzysty, ka-
sztanowce, kasztan jadalny), lub które produkuj¹ nasiona póŸno i nieregularnie (np.
modrzew, buk zwyczajny, jod³a pospolita),
– œcis³y zwi¹zek kultur tkankowych z in¿ynieri¹ genetyczn¹ (transformacje
genetyczne).
2. HISTORIA BADAÑ KULTUR TKANKOWYCH
Po raz pierwszy problem hodowli organów i tkanek roœlinnych in vitro zosta³
podjêty przez Haberlandta w 1902 r., który twierdzi³, ¿e komórki ka¿dej roœliny
hodowane w odpowiednich warunkach mog¹ zainicjowaæ regeneracjê roœlin (póŸ-
niej na tym stwierdzeniu zosta³a oparta teoria totipotencji, M³odzianowski 1984).
W 1934 r. sukcesem zakoñczy³y siê doœwiadczenia White’a (1934), który uzyska³
d³ugotrwa³y wzrost korzeni pomidora zwyczajnego
(Lycopersicon esculentum)
,
stosuj¹c po¿ywkê mineraln¹ uzupe³nion¹ glukoz¹ i wyci¹giem z dro¿d¿y. Po-
dobnie nieograniczony wzrost tkanki roœlinnej in vitro uzyskali w 1939 r. we
Francji Gautheret oraz Nobecourt (M³odzianowski 1984). W Polsce ju¿ w latach
1952–1953 pojawi³y siê prace nad podzia³ami j¹der i komórek w eksplantatach
oraz nad hodowl¹ tkanek. W latach 1948–1959 pionierami prac z zakresu metody
hodowli in vitro tkanek roœlinnych i izolowanych zarodków byli prof. J. Czosno-
wski ze wspó³pracownikami oraz prof. A. Szweykowska (M³odzianowski 1984).
Od tego czasu metoda hodowli in vitro stosowana jest w naszym kraju w wielu
placówkach naukowych.
Pocz¹tkowo do regeneracji roœlin drzewiastych u¿ywano tkanki kambialnej
(Gautheret 1934), ze wzglêdu na du¿¹ zawartoœæ w niej endogennych hormonów
wzrostu (auksyn i cytokinin). Dopiero po odkryciu cytokinin zaczêto wykorzy-
stywaæ do hodowli tkanek inne Ÿród³a eksplantatów. Z 1940 r. pochodz¹ do-
niesienia o mo¿liwoœci regeneracji p¹ków przybyszowych z tkanki kalusa wi¹zu
Ulmus campestris
(Gautheret 1940)
.
Podobne wyniki otrzyma³ Jacquiot (1949,
1955), prowadz¹c badania na tym samym gatunku, a tak¿e brzozie (
Betula ver-
rucosa
)
.
Poza p¹kami przybyszowymi uzyska³ on równie¿ zacz¹tki korzeni, jednak
nie uda³o siê mu wyhodowaæ ca³kowicie wykszta³conych roœlin. Pierwsz¹ kom-
pletn¹ roœlin¹ by³a osika zregenerowana z liœcia w 1970 r. (Winton 1970), co za-
pocz¹tkowa³o intensywne badania nad rozmna¿aniem wegetatywnym drzew w
kulturach in vitro.
W 1958 r. otrzymano pierwsze roœlinne somatyczne zarodki u marchwi (
Da-
ucus carota
) (Steward 1958), a siedem lat póŸniej zarodki drzewa sanda³owego
(Santalum album
) Rao (1965).
74
K. Szczygie³
O du¿ych mo¿liwoœciach somatycznej embriogenezy jako metody szybkiego
rozmna¿ania in vitro gatunków drzew iglastych donosili Thorpe i Biondi (1984),
Dunstan (1988), Becwar i in. (1988). Pionierskie badania nad somatyczn¹ em-
briogenez¹ drzew iglastych prowadzone by³y ju¿ wczeœniej, w latach 1968–1980.
Przoduj¹cym laboratorium prowadz¹cym badania w tym zakresie by³ oœrodek
kierowany przez prof. D. J. Durzana i wspó³pracowników (w Kanadzie), w którym
badano rozwój i metabolizm kalusa oraz komórek zawiesinowych gatunków drzew
iglastych (Durzan i Steward 1968, Chalupa i Durzan 1973, Durzan i Chalupa 1976).
Wprawdzie obserwowano ró¿ne struktury podobne do zarodków, nie uzyskano
jednak z nich zarodków ani roœlin. Pierwsze doniesienie o mo¿liwoœci rozmna¿ania
przez somatyczne zarodki gatunków drzew iglastych pochodzi z 1985 r., gdy
Hakman i in. (1985) oraz Chalupa (1985) uzyskali inicjacjê somatycznej em-
briogenezy u œwierka pospolitego (
Picea abies
Karst.). Jako eksplantaty zasto-
sowano dojrza³e i niedojrza³e zygotyczne zarodki. Uzyskano 38% frekwencjê
inicjacji kalusa embriogennego (procent eksplantatów tworz¹cych tkankê em-
briogenn¹) z niedojrza³ych zarodków, 8% z dojrza³ych (Chalupa 1985) oraz so-
matyczne zarodki, a z nich siewki. W laboratorium szwedzkim Hakman ze wspó³-
pracownikami (1985) otrzymali w 50% inicjacjê tkanki embriogennej, stosuj¹c
równie¿ jako eksplantaty niedojrza³e zarodki zygotyczne œwierka pospolitego. W
tym samym roku równie¿ zainicjowano kalus embriogenny (Nagmani i Bonga
1985) z megagametofitu (prabielma z niedojrza³ym zarodkiem) modrzewia
europejskiego (
Larix decidua
Mill.), a w 1986 r. Erdelsky i Barancok pierwsi
otrzymali tkankê embriogenn¹ u jod³y pospolitej (
Abies alba
Mill.), wykorzystuj¹c
jako eksplantat dojrza³y zarodek zygotyczny. Nale¿y podkreœliæ, ¿e pierwsze so-
matyczne siewki œwierka pospolitego wyhodowali Hakman i von Arnold (1985)
oraz Chalupa (1985). W tym samym roku Nagmani i Bonga (1985) uzyskali
pierwsz¹ siewkê modrzewia europejskiego (haploidaln¹), a dopiero w 1995 r.
Hristoforoglu ze wspó³pracownikami (1995) otrzymali siewki somatyczne jod³y
pospolitej.
Od tego czasu w wielu laboratoriach rozpoczêto intensywne badania nad
mo¿liwoœci¹ rozmna¿ania in vitro ró¿nych gatunków drzew iglastych metod¹
somatycznej embriogenezy.
Obecnie metod¹ somatycznej embriogenezy rozmna¿anych jest ponad 300
gatunków roœlin (Bajaj 1995, Dunstan i in. 1995), w tym 120 gatunków drzew
liœciastych, wœród nich liczne drzewa leœne, jak:
Fagus silvatica
(Jorgensen 1988),
Fraxinus
spp. (Preece i in. 1987),
Juglans
spp. (Cornu 1988),
Populus
spp. (Chen i
in. 1988),
Robinia
(Wang i in. 1982),
Quercus robur
i
Tilia cordata
(Chalupa
1990), (Kendurkar i in. 1995), i ponad 50 gatunków drzew iglastych (Gupta i Grob
1995, Minocha i Minocha 1995, Raemakers i in. 1999).
Somatyczna embriogeneza – alternatywny sposób uzyskania wyselekcjonowanego materia³u...
75
3. MIKROROZMNA¯ANIE GATUNKÓW DRZEW IGLASTYCH
Mikrorozmna¿anie drzew (klonowanie – wegetatywne rozmna¿anie drzew in
vitro) mo¿na uzyskaæ stosuj¹c dwie metody: organogenezê i somatyczn¹ embrio-
genezê.
Organogeneza jest sposobem klonowania polegaj¹cym na formowaniu or-
ganów roœlinnych na eksplantacie pod wp³ywem roœlinnych regulatorów wzrostu
(hormonów). Umieszczenie eksplantatu (p¹ki wierzcho³kowe i k¹towe, pêd 1–2 cm
z p¹kiem, liœcieñ, ig³a, liœæ, zarodek) na po¿ywce uzupe³nionej cytokininami lub
cytokinin¹ i auksyn¹ powoduje aktywacjê merystemów pêdowych, w wyniku
czego powstaj¹ mikropêdy (mikrosadzonki), które nastêpnie s¹ ukorzeniane w
po¿ywkach o wy¿szym stê¿eniu auksyn ni¿ cytokinin, w warunkach in vitro lub ex
vitro. Do ukorzeniania mikrosadzonek stosowane s¹ substraty (najczêœciej mie-
szanina torfu z perlitem lub wermikulitem) oraz hormony wzrostu w preparatach
proszkowych. Stosuj¹c t¹ metodê z jednego eksplantatu pierwotnego mo¿na uzys-
kaæ od 10 do 50 nowych roœlin.
Bardziej wydajn¹ metod¹ rozmna¿ania drzew in vitro jest somatyczna em-
briogeneza, dziêki której w krótkim czasie mo¿liwie jest otrzymanie du¿ej liczby
genetycznie identycznych osobników (klon) z ma³ej iloœci materia³u wyjœciowego
– eksplantatu (co umo¿liwia masowe, klonalne rozmna¿anie). Proces ten polega na
formowaniu i rozwoju zarodków z komórek somatycznych (wegetatywnych) z
pominiêciem zap³odnienia i zygoty. Tautorus i in. (1991) definiuj¹ j¹ jako metodê
bezp³ciowego rozmna¿ania, która odtwarza normalny proces rozwoju zarodka w
nasieniu. Somatyczne zarodki s¹ identyczne lub podobne do zygotycznych, maj¹
zdolnoœæ kie³kowania i regeneracji siewek. Wed³ug Malepszego i Wróblewskiego
(1994) jest to proces morfogenetyczny, w wyniku którego z komórki lub komórek
roœlinnych (z wy³¹czeniem zygoty i gamet) powstanie struktura o morfologii zbli-
¿onej lub identycznej z morfologi¹ któregoœ ze stadiów rozwojowych zarodka
zygotycznego.
Zasadnicza ró¿nica miêdzy obydwoma metodami mikrorozmna¿ania polega
na tym, ¿e podczas organogenezy dochodzi do formowania organów na eks-
plantacie, a w wyniku somatycznej embriogenezy powstaj¹ somatyczne zarodki.
Proces somatycznej embriogenezy zachodzi poprzez nastêpuj¹ce fazy:
1) inicjacjê kalusa embriogennego na eksplantacie,
2) namna¿anie kalusa embriogennego (tworzenie somatycznych zarodków),
3) dojrzewanie somatycznych zarodków,
4) kie³kowanie somatycznych zarodków,
5) konwersjê somatycznych zarodków w siewki.
Faza inicjacji kalusa embriogennego na eksplantacie
Somatyczna embriogeneza mo¿e zachodziæ bezpoœrednio z komórek eks-
plantatu lub poœrednio poprzez stadium kalusa embriogennego powstaj¹cego na
Plik z chomika:
Dama-pienkowa
Inne pliki z tego folderu:
Projekt szkółki lenej.doc
(55 KB)
Wytyczne do projektu szkółki.doc
(57 KB)
Siewki.pdf
(2002 KB)
Wykonanie szczepień drzew leśnych.doc
(84 KB)
szkolki.rar
(11303 KB)
Inne foldery tego chomika:
Atlas uszkodzeń drzew leśnych
Dendrometria
Drzewoznawstwo
Ekologia
Entomologia
Zgłoś jeśli
naruszono regulamin