rozmnażanie wegetatywne, szczepienie,somatyczna embriogeneza.pdf

L EŒNE P RACE B ADAWCZE , 2005, 3: 71–92.

Krystyna S ZCZYGIE£ *

SOMATYCZNA EMBRIOGENEZA – ALTERNATYWNY

SPOSÓB UZYSKANIA WYSELEKCJONOWANEGO

MATERIA£U SADZENIOWEGO GATUNKÓW DRZEW

IGLASTYCH

SOMATIC EMBRYOGENESIS – AN ALTERNATIVE WAY TO PRODUCE

IMPROVED PLANTING STOCK OF CONIFEROUS TREE SPECIES

Abstract . Somatic embryogenesis in conifers as an effective vegetative propa-

gation method, offers a great multiplicative potential in a short time as well as

the possibility of cryopreservation the embryogenic tissue. Mass vegetative

propagation via tissue culture (micropropagation, clonal propagation) of se-

lected, improved material give many advantages over conventional methods

(cutting, grafting). Plants can be produced by tissue culture through one of two

different pathways: organogenesis or somatic embryogenesis. Organogenesis

is developmental process where organ primordia are initiated on a explant (for

ex. bud, leaf), after exogenously applied hormones. After organ initiation sev-

eral steps – shoot elonagation, rooting and acclimatization are required to ob-

tain plant. Somatic embryogenesis – is the process of formation and

development of somatic embryos from vegetative (somatic) tissue. This process

can be divided into different steps: 1) initiation of embryogenic tissue from the

primary explant (mature or immature zygotic embryo, cotyledon, needle), 2)

multiplication of embryogenic tissue, 3) maturation of somatic embryos, 4) ger-

mination of somatic embryos, 5) plant regeneration. A short historical aspects

of somatic embryogenesis in woody plants and its application for forest regen-

eration is presented. Vegetatively propagated material via somatic embryo-

genesis offers many advantages over seed material and can be used for forest

tree breeding and reforestation programmes.

Key words: explant, organogenesis, somatic embryogenesis, somatic embryo,

embryogenic tissue (callus).

* Instytut Badawczy Leœnictwa, Zak³ad Genetyki i Fizjologii Drzew Leœnych, Sêkocin Las,

05-090 Raszyn, e-mail: szczygik@ibles.waw.pl

K. Szczygie³

1. WPROWADZENIE

Wegetatywne rozmna¿anie drzew, polegaj¹ce na uzyskiwaniu nowych osob-

ników drog¹ regeneracji z czêœci organizmu macierzystego, pozwala skuteczniej

ni¿ rozmna¿anie generatywne zachowaæ po¿¹dane cechy hodowlane u potomstwa.

W leœnictwie u³atwia ono szybkie wprowadzenie do praktyki wyników selekcji

drzew. Metody wegetatywnego rozmna¿ania znajduj¹ zastosowanie w leœnictwie

g³ównie ze wzglêdu na póŸne osi¹ganie przez drzewa wieku dojrza³oœci gene-

ratywnej, okresowoœæ kwitnienia i obradzania nasion oraz wystêpowanie

czynników powoduj¹cych pogorszenie stanu zdrowotnego lub wrêcz zamieranie

cennych populacji, a tak¿e w przypadku rozmna¿ania nowych form roœlin uzys-

kanych przez krzy¿owanie, a przede wszystkim w celu uzyskania wegetatywnego

potomstwa drzew doborowych i elitarnych do zak³adania plantacji nasiennych.

W szkó³karstwie leœnym wegetatywne rozmna¿anie drzew jest szeroko sto-

sowane. Tradycyjne metody mno¿enia drzew, jak ukorzenianie zrzezów pêdowych

(zdrewnia³ych i zielnych) i korzeniowych, szczepienia, odrosty czy odk³ady, maj¹

szereg ograniczeñ. Metody te czêsto wymagaj¹ specjalnych mateczników, które

musz¹ byæ odpowiednio pielêgnowane i odm³adzane, w celu zachowania przez

roœliny mateczne zdolnoœci do regeneracji. Efektywnoœæ tych metod (szczególnie

ukorzeniania zrzezów) zale¿y od wieku roœliny matecznej i jest wysoka niemal

wy³¹cznie w przypadku pozyskiwania zrzezów z m³odych roœlin matecznych. Przy

wegetatywnym rozmna¿aniu drzew iglastych spotykany jest czêsto u nowopo-

wsta³ych sadzonek wzrost plagiotropowy, czyli poziomy wzrost pêdów, bez wy-

raŸnego przewodnika. Natomiast przy szczepieniu utrudnieniem jest wyrastanie z

podk³adek pêdów konkuruj¹cych ze zrazami, co w wypadku plantacji nasiennych

jest ca³kowicie niedopuszczalne. Ponadto, stosuj¹c tradycyjne metody uzyskuje siê

ma³¹ wydajnoœæ rozmna¿ania z jednej roœliny matecznej.

Najnowszym sposobem masowego, klonalnego rozmna¿ania drzew jest ich we-

getatywne rozmna¿anie in vitro, metod¹ hodowli tkanek (tzw. mikrorozmna¿anie).

Podstawowe zalety i cele rozmna¿ania drzew leœnych metod¹ kultur tkan-

kowych to:

– mo¿liwoœæ uzyskania w krótkim czasie du¿ej liczby genetycznie iden-

tycznych osobników (rozmna¿anie klonalne) z ma³ej iloœci materia³u wyjœciowego

(eksplantaty pierwotne: dojrza³e i niedojrza³e zarodki zygotyczne, liœcienie, ig³y,

liœcie, p¹ki wierzcho³kowe i boczne),

– kriokonserwacja materia³u uzyskanego drog¹ in vitro: wykorzystanie ma-

teria³u otrzymanego drog¹ somatycznej embriogenezy (kalus embriogenny, so-

matyczne zarodki i sztuczne nasiona) oraz organogenezy (p¹ki, pêdy z p¹kami) do

d³ugoterminowego przechowywania w ciek³ym azocie w temperaturze -196 °C,

– mo¿liwoœæ otrzymania w krótkim okresie wartoœciowego wyselekcjono-

wanego materia³u sadzeniowego, ulepszonego genetycznie ze wzglêdu na war-

toœciowe cechy dla leœnictwa, ró¿nych ga³êzi przemys³u czy produkcjê metabo-

litów wtórnych dla potrzeb farmacji i przemys³u kosmetycznego,

Somatyczna embriogeneza – alternatywny sposób uzyskania wyselekcjonowanego materia³u... 73

– mo¿liwoœæ regeneracji gatunków drzew, które trudno rozmna¿aj¹ siê

tradycyjnymi metodami wegetatywnego mno¿enia (np. sosna, d¹b, buk),

– rozmna¿anie gatunków drzew, których nasiona s¹ trudne do przechowy-

wania przez d³ugi okres (tzw. „recalcitrant” – dêby, jawor, klon srebrzysty, ka-

sztanowce, kasztan jadalny), lub które produkuj¹ nasiona póŸno i nieregularnie (np.

modrzew, buk zwyczajny, jod³a pospolita),

– œcis³y zwi¹zek kultur tkankowych z in¿ynieri¹ genetyczn¹ (transformacje

genetyczne).

2. HISTORIA BADAÑ KULTUR TKANKOWYCH

Po raz pierwszy problem hodowli organów i tkanek roœlinnych in vitro zosta³

podjêty przez Haberlandta w 1902 r., który twierdzi³, ¿e komórki ka¿dej roœliny

hodowane w odpowiednich warunkach mog¹ zainicjowaæ regeneracjê roœlin (póŸ-

niej na tym stwierdzeniu zosta³a oparta teoria totipotencji, M³odzianowski 1984).

W 1934 r. sukcesem zakoñczy³y siê doœwiadczenia White’a (1934), który uzyska³

d³ugotrwa³y wzrost korzeni pomidora zwyczajnego (Lycopersicon esculentum) ,

stosuj¹c po¿ywkê mineraln¹ uzupe³nion¹ glukoz¹ i wyci¹giem z dro¿d¿y. Po-

dobnie nieograniczony wzrost tkanki roœlinnej in vitro uzyskali w 1939 r. we

Francji Gautheret oraz Nobecourt (M³odzianowski 1984). W Polsce ju¿ w latach

1952–1953 pojawi³y siê prace nad podzia³ami j¹der i komórek w eksplantatach

oraz nad hodowl¹ tkanek. W latach 1948–1959 pionierami prac z zakresu metody

hodowli in vitro tkanek roœlinnych i izolowanych zarodków byli prof. J. Czosno-

wski ze wspó³pracownikami oraz prof. A. Szweykowska (M³odzianowski 1984).

Od tego czasu metoda hodowli in vitro stosowana jest w naszym kraju w wielu

placówkach naukowych.

Pocz¹tkowo do regeneracji roœlin drzewiastych u¿ywano tkanki kambialnej

(Gautheret 1934), ze wzglêdu na du¿¹ zawartoœæ w niej endogennych hormonów

wzrostu (auksyn i cytokinin). Dopiero po odkryciu cytokinin zaczêto wykorzy-

stywaæ do hodowli tkanek inne Ÿród³a eksplantatów. Z 1940 r. pochodz¹ do-

niesienia o mo¿liwoœci regeneracji p¹ków przybyszowych z tkanki kalusa wi¹zu

Ulmus campestris (Gautheret 1940) . Podobne wyniki otrzyma³ Jacquiot (1949,

1955), prowadz¹c badania na tym samym gatunku, a tak¿e brzozie ( Betula ver-

rucosa ) . Poza p¹kami przybyszowymi uzyska³ on równie¿ zacz¹tki korzeni, jednak

nie uda³o siê mu wyhodowaæ ca³kowicie wykszta³conych roœlin. Pierwsz¹ kom-

pletn¹ roœlin¹ by³a osika zregenerowana z liœcia w 1970 r. (Winton 1970), co za-

pocz¹tkowa³o intensywne badania nad rozmna¿aniem wegetatywnym drzew w

kulturach in vitro.

W 1958 r. otrzymano pierwsze roœlinne somatyczne zarodki u marchwi ( Da-

ucus carota ) (Steward 1958), a siedem lat póŸniej zarodki drzewa sanda³owego

(Santalum album ) Rao (1965).

K. Szczygie³

O du¿ych mo¿liwoœciach somatycznej embriogenezy jako metody szybkiego

rozmna¿ania in vitro gatunków drzew iglastych donosili Thorpe i Biondi (1984),

Dunstan (1988), Becwar i in. (1988). Pionierskie badania nad somatyczn¹ em-

briogenez¹ drzew iglastych prowadzone by³y ju¿ wczeœniej, w latach 1968–1980.

Przoduj¹cym laboratorium prowadz¹cym badania w tym zakresie by³ oœrodek

kierowany przez prof. D. J. Durzana i wspó³pracowników (w Kanadzie), w którym

badano rozwój i metabolizm kalusa oraz komórek zawiesinowych gatunków drzew

iglastych (Durzan i Steward 1968, Chalupa i Durzan 1973, Durzan i Chalupa 1976).

Wprawdzie obserwowano ró¿ne struktury podobne do zarodków, nie uzyskano

jednak z nich zarodków ani roœlin. Pierwsze doniesienie o mo¿liwoœci rozmna¿ania

przez somatyczne zarodki gatunków drzew iglastych pochodzi z 1985 r., gdy

Hakman i in. (1985) oraz Chalupa (1985) uzyskali inicjacjê somatycznej em-

briogenezy u œwierka pospolitego ( Picea abies Karst.). Jako eksplantaty zasto-

sowano dojrza³e i niedojrza³e zygotyczne zarodki. Uzyskano 38% frekwencjê

inicjacji kalusa embriogennego (procent eksplantatów tworz¹cych tkankê em-

briogenn¹) z niedojrza³ych zarodków, 8% z dojrza³ych (Chalupa 1985) oraz so-

matyczne zarodki, a z nich siewki. W laboratorium szwedzkim Hakman ze wspó³-

pracownikami (1985) otrzymali w 50% inicjacjê tkanki embriogennej, stosuj¹c

równie¿ jako eksplantaty niedojrza³e zarodki zygotyczne œwierka pospolitego. W

tym samym roku równie¿ zainicjowano kalus embriogenny (Nagmani i Bonga

1985) z megagametofitu (prabielma z niedojrza³ym zarodkiem) modrzewia

europejskiego ( Larix decidua Mill.), a w 1986 r. Erdelsky i Barancok pierwsi

otrzymali tkankê embriogenn¹ u jod³y pospolitej ( Abies alba Mill.), wykorzystuj¹c

jako eksplantat dojrza³y zarodek zygotyczny. Nale¿y podkreœliæ, ¿e pierwsze so-

matyczne siewki œwierka pospolitego wyhodowali Hakman i von Arnold (1985)

oraz Chalupa (1985). W tym samym roku Nagmani i Bonga (1985) uzyskali

pierwsz¹ siewkê modrzewia europejskiego (haploidaln¹), a dopiero w 1995 r.

Hristoforoglu ze wspó³pracownikami (1995) otrzymali siewki somatyczne jod³y

pospolitej.

Od tego czasu w wielu laboratoriach rozpoczêto intensywne badania nad

mo¿liwoœci¹ rozmna¿ania in vitro ró¿nych gatunków drzew iglastych metod¹

somatycznej embriogenezy.

Obecnie metod¹ somatycznej embriogenezy rozmna¿anych jest ponad 300

gatunków roœlin (Bajaj 1995, Dunstan i in. 1995), w tym 120 gatunków drzew

liœciastych, wœród nich liczne drzewa leœne, jak: Fagus silvatica (Jorgensen 1988),

Fraxinus spp. (Preece i in. 1987), Juglans spp. (Cornu 1988), Populus spp. (Chen i

in. 1988), Robinia (Wang i in. 1982), Quercus robur i Tilia cordata (Chalupa

1990), (Kendurkar i in. 1995), i ponad 50 gatunków drzew iglastych (Gupta i Grob

1995, Minocha i Minocha 1995, Raemakers i in. 1999).

Somatyczna embriogeneza – alternatywny sposób uzyskania wyselekcjonowanego materia³u... 75

3. MIKROROZMNA¯ANIE GATUNKÓW DRZEW IGLASTYCH

Mikrorozmna¿anie drzew (klonowanie – wegetatywne rozmna¿anie drzew in

vitro) mo¿na uzyskaæ stosuj¹c dwie metody: organogenezê i somatyczn¹ embrio-

genezê.

Organogeneza jest sposobem klonowania polegaj¹cym na formowaniu or-

ganów roœlinnych na eksplantacie pod wp³ywem roœlinnych regulatorów wzrostu

(hormonów). Umieszczenie eksplantatu (p¹ki wierzcho³kowe i k¹towe, pêd 1–2 cm

z p¹kiem, liœcieñ, ig³a, liœæ, zarodek) na po¿ywce uzupe³nionej cytokininami lub

cytokinin¹ i auksyn¹ powoduje aktywacjê merystemów pêdowych, w wyniku

czego powstaj¹ mikropêdy (mikrosadzonki), które nastêpnie s¹ ukorzeniane w

po¿ywkach o wy¿szym stê¿eniu auksyn ni¿ cytokinin, w warunkach in vitro lub ex

vitro. Do ukorzeniania mikrosadzonek stosowane s¹ substraty (najczêœciej mie-

szanina torfu z perlitem lub wermikulitem) oraz hormony wzrostu w preparatach

proszkowych. Stosuj¹c t¹ metodê z jednego eksplantatu pierwotnego mo¿na uzys-

kaæ od 10 do 50 nowych roœlin.

Bardziej wydajn¹ metod¹ rozmna¿ania drzew in vitro jest somatyczna em-

briogeneza, dziêki której w krótkim czasie mo¿liwie jest otrzymanie du¿ej liczby

genetycznie identycznych osobników (klon) z ma³ej iloœci materia³u wyjœciowego

– eksplantatu (co umo¿liwia masowe, klonalne rozmna¿anie). Proces ten polega na

formowaniu i rozwoju zarodków z komórek somatycznych (wegetatywnych) z

pominiêciem zap³odnienia i zygoty. Tautorus i in. (1991) definiuj¹ j¹ jako metodê

bezp³ciowego rozmna¿ania, która odtwarza normalny proces rozwoju zarodka w

nasieniu. Somatyczne zarodki s¹ identyczne lub podobne do zygotycznych, maj¹

zdolnoœæ kie³kowania i regeneracji siewek. Wed³ug Malepszego i Wróblewskiego

(1994) jest to proces morfogenetyczny, w wyniku którego z komórki lub komórek

roœlinnych (z wy³¹czeniem zygoty i gamet) powstanie struktura o morfologii zbli-

¿onej lub identycznej z morfologi¹ któregoœ ze stadiów rozwojowych zarodka

zygotycznego.

Zasadnicza ró¿nica miêdzy obydwoma metodami mikrorozmna¿ania polega

na tym, ¿e podczas organogenezy dochodzi do formowania organów na eks-

plantacie, a w wyniku somatycznej embriogenezy powstaj¹ somatyczne zarodki.

Proces somatycznej embriogenezy zachodzi poprzez nastêpuj¹ce fazy:

1) inicjacjê kalusa embriogennego na eksplantacie,

2) namna¿anie kalusa embriogennego (tworzenie somatycznych zarodków),

3) dojrzewanie somatycznych zarodków,

4) kie³kowanie somatycznych zarodków,

5) konwersjê somatycznych zarodków w siewki.

Faza inicjacji kalusa embriogennego na eksplantacie

Somatyczna embriogeneza mo¿e zachodziæ bezpoœrednio z komórek eks-

plantatu lub poœrednio poprzez stadium kalusa embriogennego powstaj¹cego na

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: