chemzwnatBBialka.pdf

POLITECHNIKA ĺLġSKA

WYDZIAý CHEMICZNY

K ATEDRA C HEMII O RGANICZNEJ , B IOORGANICZNEJ

I B IOTECHNOLOGII

Ę WICZENIE 4

Oznaczanie masy czĢsteczkowej biaþek metodĢ

filtracji Ňelowej

Laboratorium z Chemii ZwiĢzkw

Naturalnych

Miejsce ęwiczenia: sala 102

ProwadzĢcy: dr inŇ. Ilona WANDZIK

Opracowanie: dr inŇ. Ilona WANDZIK

Ęwiczenie 4. Oznaczanie masy czĢsteczkowej biaþek metodĢ filtracji Ňelowej

2/11

1. Cel ęwiczenia

Celem ęwiczenia jest oznaczenie masy czĢsteczkowej a-amylazy metodĢ filtracji Ňelowej.

Ęwiczenie skþada siħ z dwch zasadniczych czħĻci:

wykalibrowania kolumny Sephadex G-75 za pomocĢ makroczĢsteczek o znanej masie

czĢsteczkowej (bþħkit dekstranowy, hemoglobina, witamina B-12, cytochrom C).

uŇycie wykalibrowanej kolumny do oznaczenia masy czĢsteczkowej wybranego biaþka.

2. Wstħp teoretyczny

Polipeptydy i biaþka

Polipeptydy i biaþka sĢ polimerami wielkoczĢsteczkowymi zþoŇonymi z a-aminokwasw.

Pojedyncze czĢsteczki a-aminokwasw poþĢczone sĢ ze sobĢ wiĢzaniami amidowymi

(peptydowymi). WiĢzanie peptydowe powstaje w ten sposb, Ňe grupa aminowa jednego

aminokwasu þĢczy siħ z grupĢ karboksylowĢ drugiego z wydzieleniem czĢsteczki wody.

CNCHC

CH C

Liczbħ powiĢzanych aminokwasw (dþugoĻę þaıcucha) moŇna z pewnym przybliŇeniem

okreĻlię przez oznaczenie masy czĢsteczkowej biaþka. Przyjmuje siħ, Ňe Ļrednia masa

czĢsteczkowa aminokwasu wynosi 115 Da. Polimery aminokwasw o masie czĢsteczkowej

do 10 000 sĢ zaliczane do polipeptydw, natomiast polimery o masie czĢsteczkowej

przekraczajĢcej tĢ wartoĻę zalicza siħ do biaþek. Masħ czĢsteczkowĢ biaþek i innych

makroczĢsteczek poza metodĢ spektrometrii masowej moŇna oznaczyę m. in.: metodĢ

sedymentacji w ultrawirowaniu, metodĢ elektroforezy lub filtracji Ňelowej. Masy

czĢsteczkowe biaþek wahajĢ siħ w granicach od ok. 11,5 kDa do wielu milionw Daltonw.

Przykþadowe masy czĢsteczkowe biaþek najczħĻciej stosowanych jako markery masy

czĢsteczkowej przedstawia Tabela 1 .

Tabela 1. Masy czĢsteczkowe biaþek Î markerw.

Biaþko

Masa czĢsteczkowa (Da)

a-lactalbumin z mleka krowiego

14 200

Lizozym z jaja kurzego

14 300

Mioglobina

15 000

Inhibitor trypsyny z soi

20 100

Anhydraza wħglanowa

29 000

Albumina jaja kurzego

45 000

a-amylaza z Bacillus species

53 000

Hemoglobina

68 000

Albumina surowicy woþowej

67 000

Fosforylaza B z miħĻni krlika

94 000

b-galaktozydaza z Escherichia coli

116 000

Miozyna z miħĻni krlika

205 000

Blue Dextran

2 000 000

Cytochrom C

Witamina B-12

Bþħkit tymolowy

12 400

1 355

483

Ęwiczenie 4. Oznaczanie masy czĢsteczkowej biaþek metodĢ filtracji Ňelowej

3/11

Istnieje kilka sposobw klasyfikacji biaþek, z ktrych najbardziej rozpowszechniony dzieli

biaþka ze wzglħdu na budowħ na biaþka proste i zþoŇone. Biaþka proste zbudowane sĢ z

þaıcuchw polipeptydowych, ktre po hydrolizie dajĢ wyþĢcznie aminokwasy lub ich

pochodne. Biaþka zþoŇone skþadajĢ siħ z czĢsteczki biaþka prostego poþĢczonego z innĢ,

niebiaþkowĢ czĢsteczkĢ, zwykle organicznĢ (tzw. grupĢ prostetycznĢ) z udziaþem wiĢzaı

kowalencyjnych, jonowych i koordynacyjnych.

Ze wzglħdu na ksztaþt czĢsteczki, wyrŇnia siħ biaþka wþkniste (fibrylarne) i kþħbuszkowe

(globularne). Biaþka fibrylarne sĢ podstawowymi elementami budowy tkanek zwierzħcych,

charakteryzujĢ siħ znacznĢ asymetriĢ czĢsteczek, tj. duŇym stosunkiem dþugoĻci osi dþugiej

do krtkiej. Biaþkami globularnymi sĢ enzymy, przeciwciaþa i niektre hormony. Biaþka

globularne majĢ ksztaþt eliptyczny i zazwyczaj dobrze rozpuszczajĢ siħ w wodzie.

Biaþka moŇna oczyszczaę w formie aktywnej wykorzystujĢc ich wþaĻciwoĻci

fizykochemiczne, takie jak:

wielkoĻę,

þadunek,

rozpuszczalnoĻę,

specyficzne powinowactwo wiĢzania do innych czĢsteczek.

TechnikĢ wykorzystywanĢ do rozdziaþu makroczĢsteczek jest chromatografia. Gþwnie

stosowane typy chromatografii to:

filtracja Ňelowa ; rozdziaþ nastħpuje z uwagi na rozmiar czĢsteczek,

chromatografia jonowymienna ; wykorzystuje siħ rŇnice w þadunku wypadkowym

odmiennych czĢsteczek biaþkowych

chromatografia powinowactwa ; wykorzystuje siħ powinowactwo biaþek do

specyficznych grup chemicznych,

wysokociĻnieniowa chromatografia cieczowa ; usprawnia wczeĻniej wymienione

metody chromatograficzne.

Przedmiotem ęwiczenia jest oznaczanie masy czĢsteczkowej M CZ biaþek metodĢ filtracji

Ňelowej, dlatego tylko ta technika zostanie omwiona w instrukcji.

Chromatografia metodĢ filtracji Ňelowej.

Filtracja Ňelowa, inaczej chromatografia rozmiarw wykluczajĢcych jest technikĢ majĢcĢ

zastosowanie preparatywne do oczyszczania biaþek lub innych makroczĢsteczek. Ponadto za

pomocĢ filtracji Ňelowej moŇna oznaczaę masħ czĢsteczkowĢ biaþek i innych biopolimerw.

W filtracji Ňelowej:

Kryterium rozdziaþu makroczĢsteczek jest ich wielkoĻę.

Wiħksze czĢsteczki wymywane sĢ z kolumny jako pierwsze.

Mniejsze czĢsteczki wymywane sĢ z kolumny jako ostatnie.

Dlaczego makroczĢsteczki o rŇnych M CZ wymywane sĢ z rŇnĢ szybkoĻciĢ?

Zasada separacji przedstawiona na Rysunku 1 oparta jest na wykorzystaniu porowatoĻci

wypeþnienia kolumny. Wypeþnienie takie zawiera liczne mikroskopijne kanaliki lub pory o

powtarzalnej wielkoĻci. Po naniesieniu na kolumnħ rozdzielanych substancji, nastħpuje

wymywanie poszczeglnych skþadnikw mieszaniny za pomocĢ buforu wymywajĢcego.

Wzglħdnie maþe czĢsteczki mogĢ przemieszczaę siħ pomiħdzy ziarnami zþoŇa lub wnikaę do

Ęwiczenie 4. Oznaczanie masy czĢsteczkowej biaþek metodĢ filtracji Ňelowej

4/11

wewnĢtrz porw. Z kolei wiħksze czĢsteczki mogĢ tylko przemieszczaę siħ pomiħdzy

ziarnami zþoŇa. JeĻli jakaĻ czĢsteczka wniknie w gþĢb pora jej przemieszczanie w dþ

kolumny zostaje spowolnione, gdyŇ przepþyw buforu wymywajĢcego wewnĢtrz ziaren jest

duŇo wolniejszy niŇ na zewnĢtrz. A zatem czĢsteczki znajdujĢce siħ w mieszaninie ulegajĢ

podziaþowi pomiħdzy fazy V O (poza ziarnami zþoŇa) i V I (wewnĢtrz ziaren zþoŇa, w porach

Ňelu).

Prbka biaþka

Ziarno zþoŇa

Maþe czĢsteczki zatrzymywane

sĢ w porach ziaren

Maþe czĢsteczki wymywane

jako ostatnie

DuŇe czĢsteczki wymywane

jako pierwsze

Rysunek 1. Chromatografia na drodze filtracji Ňelowej

Podstawowe oznaczenia:

V E ObjħtoĻę elucji

V O ObjħtoĻę swobodna (martwa), czyli objħtoĻę cieczy zalegajĢcej miħdzy ziarenkami Ňelu

V T ObjħtoĻę caþkowita

V M ObjħtoĻę samego Ňelu

V I ObjħtoĻę wewnħtrzna, objħtoĻę cieczy zawartej w porach Ňelu

Eluent Î rozpuszczalnik stosowany do wymywania (elucji) skþadnikw mieszaniny z

kolumny chromatograficznej

Eluat - roztwr wypþywajĢcy z kolumny chromatograficznej, eluent wraz z rozpuszczonymi

w nim skþadnikami rozdzielanej chromatograficznie mieszaniny.

ObjħtoĻę cieczy poza zþoŇem nazywana jest objħtoĻciĢ swobodnĢ i oznaczana V O . ObjħtoĻę

swobodnĢ V O moŇna wyznaczyę przepuszczajĢc przez kolumnħ substancjħ barwnĢ o bardzo

duŇej masie czĢsteczkowej, ktra w ogle nie wniknie do porw. NajczħĻciej stosuje siħ

bþħkit dekstranowy , polisacharyd o masie czĢsteczkowej rzħdu 2*10 6 Da. Mierzy siħ iloĻę

wycieku od chwili naniesienia prbki do momentu jej wyjĻcia z kolumny. Z kolei V I moŇna

wyznaczyę, przepuszczajĢc przez kolumnħ substancjħ barwnĢ o bardzo maþej masie

czĢsteczkowej. CaþkowitĢ objħtoĻę utworzonego wypeþnienia moŇna okreĻlię wzorem:

V T = V O + V I + V M

gdzie V M oznacza objħtoĻę samego Ňelu, ktrĢ jako znacznie mniejszĢ od pozostaþych pomija

siħ.

Ęwiczenie 4. Oznaczanie masy czĢsteczkowej biaþek metodĢ filtracji Ňelowej

5/11

Wyznaczanie objħtoĻci elucji V E skþadnikw mieszaniny

Zazwyczaj wyciek z kolumny zbierany jest w postaci frakcji o okreĻlonej objħtoĻci. W

wiħkszoĻci przypadkw wymywane makroczĢsteczki nie sĢ barwne, a zatem zachodzi

koniecznoĻę oznaczenia, ktre frakcje zawierajĢ biaþko i w jakiej iloĻci. Oznaczenia takiego

naleŇy dokonaę za pomocĢ innych technik, jak np. analiza spektrofotometryczna frakcji,

elektroforeza w warunkach denaturujĢcych lub pomiar aktywnoĻci enzymatycznej

poszczeglnych frakcji (gdy oznaczane biaþko jest enzymem i znany jest jego substrat). W

przypadku substancji barwnych jako V E moŇna przyjĢę ĻrodkowĢ wartoĻę objħtoĻci pomiħdzy

pierwszĢ i ostatniĢ zebranĢ kroplĢ barwnego wycieku z kolumny. Oznaczone stħŇenia

makroczĢsteczek przedstawia siħ w funkcji objħtoĻci elucji ( Rysunek 2 )

StħŇenie

V E

Rysunek 2. StħŇenie poszczeglnych skþadnikw w funkcji objħtoĻci elucji

Podczas filtracji prbki zþoŇonej z kilku skþadnikw o zrŇnicowanych wielkoĻciach, duŇe

czĢsteczki bħdĢ sporadycznie wnikaþy do porw, ale zostanĢ wymyte z kolumny pŅniej w

stosunku do bþħkitu dekstranowego. Z kolei maþe czĢsteczki, ktre bħdĢ regularnie wnikaþy do

porw Ňelu opuszczĢ kolumnħ jako ostatnie. Im mniejsza czĢsteczka tym þatwiej bħdzie

zatrzymywana na Ňelu. A zatem rozmiar czĢsteczek decyduje o objħtoĻci elucji danej

substancji V E . Rozmiar geometryczny czĢsteczki skorelowany jest z masĢ czĢsteczkowĢ.

DoĻwiadczalnie wyznaczono zaleŇnoĻę masy czĢsteczkowej w funkcji objħtoĻci elucji V E . W

pewnym zakresie mas czĢsteczkowych otrzymuje siħ wykres liniowy:

log M CZ = a + b* V E /V O

wzglħdna objħtoĻę elucji Ve/Vo

Rysunek 3. ZaleŇnoĻę masy czĢsteczkowej od objħtoĻci elucji

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: