Skrypt_BM_wir2008.pdf

(1115 KB) Pobierz

Microsoft Word - skrypt BM dobry 2008 drugi.doc

Biologia molekularna

ę wiczenia

Zakład Wirusologii

Warszawa 2008

656124515.250.png

Prowadz Ģ cy:

ę wiczenie 1 dr Monika Radli ı ska

ę wiczenie 2 dr Agnieszka Kwiatek

ę wiczenie 3 mgr Maciej Łuczkiewicz,

mgr Michał Lower

ę wiczenie 4 dr Monika Adamczyk-Popławska

2

656124515.261.png

656124515.272.png

656124515.283.png

656124515.001.png

656124515.012.png

656124515.023.png

656124515.034.png

656124515.045.png

656124515.056.png

656124515.067.png

656124515.078.png

656124515.089.png

656124515.100.png

656124515.111.png

656124515.122.png

656124515.133.png

656124515.144.png

656124515.155.png

656124515.166.png

656124515.177.png

656124515.188.png

656124515.199.png

656124515.210.png

656124515.220.png

656124515.221.png

656124515.222.png

656124515.223.png

656124515.224.png

656124515.225.png

656124515.226.png

656124515.227.png

656124515.228.png

656124515.229.png

656124515.230.png

656124515.231.png

656124515.232.png

656124515.233.png

656124515.234.png

656124515.235.png

656124515.236.png

656124515.237.png

656124515.238.png

656124515.239.png

656124515.240.png

656124515.241.png

656124515.242.png

656124515.243.png

656124515.244.png

656124515.245.png

656124515.246.png

656124515.247.png

656124515.248.png

656124515.249.png

656124515.251.png

656124515.252.png

656124515.253.png

656124515.254.png

656124515.255.png

656124515.256.png

656124515.257.png

656124515.258.png

656124515.259.png

656124515.260.png

656124515.262.png

656124515.263.png

656124515.264.png

656124515.265.png

656124515.266.png

656124515.267.png

656124515.268.png

656124515.269.png

656124515.270.png

656124515.271.png

656124515.273.png

656124515.274.png

656124515.275.png

656124515.276.png

656124515.277.png

656124515.278.png

656124515.279.png

656124515.280.png

656124515.281.png

656124515.282.png

656124515.284.png

656124515.285.png

656124515.286.png

656124515.287.png

656124515.288.png

656124515.289.png

656124515.290.png

656124515.291.png

656124515.292.png

656124515.293.png

656124515.002.png

656124515.003.png

656124515.004.png

656124515.005.png

656124515.006.png

656124515.007.png

656124515.008.png

656124515.009.png

656124515.010.png

656124515.011.png

656124515.013.png

656124515.014.png

656124515.015.png

656124515.016.png

656124515.017.png

656124515.018.png

656124515.019.png

656124515.020.png

656124515.021.png

656124515.022.png

656124515.024.png

656124515.025.png

656124515.026.png

656124515.027.png

656124515.028.png

656124515.029.png

656124515.030.png

656124515.031.png

656124515.032.png

656124515.033.png

656124515.035.png

656124515.036.png

656124515.037.png

656124515.038.png

656124515.039.png

656124515.040.png

656124515.041.png

656124515.042.png

656124515.043.png

656124515.044.png

656124515.046.png

656124515.047.png

656124515.048.png

656124515.049.png

656124515.050.png

656124515.051.png

656124515.052.png

656124515.053.png

656124515.054.png

656124515.055.png

656124515.057.png

656124515.058.png

656124515.059.png

656124515.060.png

656124515.061.png

656124515.062.png

656124515.063.png

656124515.064.png

656124515.065.png

656124515.066.png

656124515.068.png

656124515.069.png

656124515.070.png

656124515.071.png

656124515.072.png

656124515.073.png

656124515.074.png

656124515.075.png

656124515.076.png

656124515.077.png

656124515.079.png

656124515.080.png

656124515.081.png

656124515.082.png

656124515.083.png

656124515.084.png

656124515.085.png

656124515.086.png

656124515.087.png

656124515.088.png

656124515.090.png

656124515.091.png

656124515.092.png

656124515.093.png

656124515.094.png

656124515.095.png

656124515.096.png

656124515.097.png

656124515.098.png

656124515.099.png

656124515.101.png

656124515.102.png

656124515.103.png

656124515.104.png

656124515.105.png

656124515.106.png

656124515.107.png

656124515.108.png

656124515.109.png

656124515.110.png

656124515.112.png

656124515.113.png

656124515.114.png

656124515.115.png

656124515.116.png

656124515.117.png

656124515.118.png

656124515.119.png

656124515.120.png

656124515.121.png

656124515.123.png

656124515.124.png

656124515.125.png

656124515.126.png

656124515.127.png

656124515.128.png

656124515.129.png

656124515.130.png

656124515.131.png

656124515.132.png

656124515.134.png

656124515.135.png

656124515.136.png

656124515.137.png

656124515.138.png

656124515.139.png

656124515.140.png

656124515.141.png

656124515.142.png

656124515.143.png

656124515.145.png

656124515.146.png

656124515.147.png

656124515.148.png

656124515.149.png

656124515.150.png

656124515.151.png

656124515.152.png

656124515.153.png

656124515.154.png

656124515.156.png

656124515.157.png

656124515.158.png

656124515.159.png

656124515.160.png

656124515.161.png

656124515.162.png

656124515.163.png

656124515.164.png

656124515.165.png

656124515.167.png

656124515.168.png

656124515.169.png

656124515.170.png

656124515.171.png

656124515.172.png

656124515.173.png

656124515.174.png

656124515.175.png

656124515.176.png

656124515.178.png

656124515.179.png

656124515.180.png

656124515.181.png

656124515.182.png

656124515.183.png

656124515.184.png

656124515.185.png

656124515.186.png

656124515.187.png

656124515.189.png

656124515.190.png

656124515.191.png

656124515.192.png

656124515.193.png

656124515.194.png

656124515.195.png

656124515.196.png

656124515.197.png

656124515.198.png

656124515.200.png

656124515.201.png

656124515.202.png

656124515.203.png

656124515.204.png

656124515.205.png

656124515.206.png

656124515.207.png

Metylaza EcoRI

Endonukleza restrykcyjna EcoRI

Brak ci ħ cia endonukleaz Ģ

restrykcyjn Ģ EcoRI

3

656124515.208.png

Ę wiczenie 1

Enzymy restrykcyjne i rekombinacja DNA in vitro

Zjawisko restrykcji – modyfikacji

Zjawisko restrykcji i modyfikacji (RM) zostało po raz pierwszy opisane w latach

pi ħę dziesi Ģ tych zeszłego wieku (Luria i Human, 1952; Bertani i Weigle, 1953). Zaobserwowano,

Ň e namna Ň anie si ħ bakteriofagów bywa w pewnym stopniu hamowane w zale Ň no Ļ ci od rodzaju

szczepu bakteryjnego podlegaj Ģ cego infekcji. Biochemiczne podło Ň e i enzymy odpowiedzialne

za to zjawisko scharakteryzowali Arber i Dussiox (1962). W 1978r Werner Arber, Hamilton O.

Smith i Daniel Nathans otrzymali Nagrod ħ Nobla w medycynie za odkrycie enzymów

restrykcyjnych, które doprowadziło do rozkwitu technologii rekombinacji DNA.

MTaz a

CH 3

MTaz a

CH 3

ENaz a

ENaz a

Chromosom

prokariotyczny

CH 3

ENaza

MTaz a

CH 3

fragmenty

zdegradowanego

fagowego DNA

MTaz a

Rys 1. Zjawisko restrykcji-modyfikacji.

W systemie RM wyró Ň nia si ħ dwie aktywno Ļ ci enzymatyczne: restrykcyjn Ģ (ENaza,

endonukleaza restrykcyjna) oraz modyfikuj Ģ c Ģ (MTaza, metylotransferaza DNA, metylaza

DNA), które rozpoznaj Ģ w DNA t ħ sam Ģ , specyficzn Ģ sekwencj ħ . MTaza modyfikuje okre Ļ lon Ģ

zasad ħ w sekwencji rozpoznawanej. Je Ļ li sekwencja docelowa nie jest zmetylowana, ENaza

przeprowadza ci ħ cie endonukleolityczne DNA (Rys. 1 i 2).

Zmodyfikowany genomowy DNA, w komórce posiadaj Ģ cej system RM, nie jest substratem

dla ENaz. Natomiast obcy DNA (np. infekuj Ģ cego faga) zostaje rozpoznany przez ENaz ħ i

strawiony. Mechanizm obronny komórek bakteryjnych przed obcym DNA np. bakteriofagowym

jest główn Ģ postulowan Ģ funkcj Ģ systemów RM (Arber i Dussoix, 1962). Według innej hipotezy

s Ģ one samolubnymi ruchomymi elementami genetycznymi, których utrzymanie w genomie jest

warunkiem przetrwania - rodzaj systemu „trucizna-odtrutka” (Kobayashi, 2001). Sugeruje si ħ te Ň

ich udział w utrzymywaniu to Ň samo Ļ ci gatunkowej bakterii (Jeltsch, 2003) oraz, Ň e przez

indukowanie rearan Ň acji genomowych przyczyniaj Ģ si ħ do zró Ň nicowania genetycznego (Arber,

2000).

4

656124515.209.png

5’ – G Ř A A TTC – 3’

3’ – CTT A A Ŗ G – 5’

CH 3

CH 3

Rys 2. Ta sama substratowa sekwencja w DNA dla endonukleazy restrykcyjnej i metylotransferazy DNA –

ró Ň ne produkty reakcji przeprowadzanych przez te enzymy.

Ze wzgl ħ du na ró Ň norodno Ļę i mnogo Ļę przedstawicieli ERaz oraz towarzysz Ģ cych im

MTaz, zostały one podzielone na cztery typy (Roberts i wsp., 2003; Tabela 1). Do Typu I

zaliczono kompleksy białkowe zło Ň one z trzech rodzajów podjednostek: rozpoznaj Ģ cych

specyficzn Ģ sekwencj ħ (S), endonukleolitycznych (R) i modyfikacyjnych (M). Enzym do ci ħ cia

wymaga obecno Ļ ci ATP. Sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna i składa si ħ z dwóch

krótkich odcinków zasad o okre Ļ lonej specyficzno Ļ ci, przedzielonych kilkoma niespecyficznymi

parami nukleotydów (np. EcoKI AACN 6 GTGC). Typ II stanowi najliczniejsz Ģ grup ħ , do niego

zaliczamy systemy składaj Ģ ce si ħ najcz ħĻ ciej z dwóch oddzielnych białek: monomerycznej

MTazy i dimerycznej ERazy. Sekwencja docelowa jest krótka (4 do 8 par zasad) i cz ħ sto

palindromiczna. Typ III systemów RM obejmuje układ składaj Ģ cy si ħ z dwóch rodzajów

podjednostek modyfikacyjnej (M) i endonukleolitycznej (E). Miejsce rozpoznawane przez te

enzymy jest niepalindromiczne o długo Ļ ci 5-6 par zasad, do ci ħ cia wymagane s Ģ jego dwie

kopie, a tak Ň e ATP. Natomiast do Typu IV zaliczono ERazy, które trawi Ģ tylko zmetylowan Ģ ni ę

DNA.

Tabela 1. Najwa Ň niejsze charakterystyczne cechy ró Ň nych typów enzymów restrykcyjnych i metylaz DNA.

Cecha

Typ I

TypII

TypIII

TypIV

Podjednostki

strukturalne

Trzy

Dwie

Dwie

Dwie (lub jedna)

Aktywno Ļę

enzymatyczna

Endonukleaza

Metylotransferaza

ATPaza

Endonukleaza

Metylotransferaza

Endonukleaza

Metylotransferaza

ATPaza

Endonukleaza

GTPaza

Kofaktory

niezb ħ dne do ci ħ cia

ATP

AdoMet

Mg 2+

Mg 2

ATP

C

(ATP)

GTP

AdoMet

Mg 2

Kofaktory

niezb ħ dne do

metylacji DNA

ATP

AdoMet

Mg 2

AdoMet

AdoMet

Mg 2

-

Rozpoznawana

sekwencja

Asymetryczna

dwucz ħĻ ciowa

Zwykle

symetryczna

Asymetryczna

Dwucz ħĻ ciowa

zmetylowana

Miejsce ci ħ cia

Losowe, co

najmniej 1000pz od

sekwencji

rozpoznawanej

W obr ħ bie, albo

tu Ň obok

sekwencji

rozpoznawanej

25-27pz od

miejsca

rozpoznawanego

W ró Ň nych

miejscach pomi ħ dzy

zmodyfikowanymi

zasadami

Translokacja DNA Tak

Nie

Tak

Tak

Typ I i III charakteryzuje brak Ļ cisłej kontroli nad poło Ň eniem miejsca ci ħ cia wzgl ħ dem

rozpoznawanej sekwencji. Natomiast enzymy Typu II przecinaj Ģ DNA w sekwencji

5

656124515.211.png

656124515.212.png

656124515.213.png

656124515.214.png

656124515.215.png

656124515.216.png

656124515.217.png

656124515.218.png

656124515.219.png

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin